Elektroforesis Gel Mendatar untuk DNA Plasmid: Mengasingkan Bentuk Supercoiled, Nicked dan Linear

Elektroforesis DNA ialah kaedah yang digunakan secara meluas dalam biologi molekul. Salah satu aplikasi yang mana tahap pemisahan tertinggi diperlukan ialah penentuan tiga bentuk topologi utama DNA plasmid, iaitu bentuk supercoiled, nicked (bulat terbuka), dan linear. Kami akan menunjukkan bagaimana Sistem Gel Mendatar HE-50 baharu menawarkan pengasingan plasmid dan kawalan kualiti yang membolehkan pemisahan dan kebolehulangan yang lebih besar.

[Lima Pertimbangan untuk Proses Elektroforesis Gel Asid Nukleik | Thermo Fisher Scientific - AS]

Topologi Plasmid: Tiga Bentuk

DNA plasmid tidak seragam dan merupakan campuran tiga isoform topologi. Dalam konteks pengasingan, bentuk ini akan menghasilkan kadar penghijrahan yang berbeza semasa elektroforesis DNA.

• Borang Supercoiled (SC): Plasmid supercoiled dianggap sebagai spesies berhijrah terpantas dalam gel agarose.

•Borang Nicked (bulat terbuka/OC): Susunan bulat DNA plasmid yang mempunyai pecah helai tunggal kini dilonggarkan dan oleh itu terkacang. Oleh kerana saiz berkesan yang lebih besar, isoform ini berhijrah lebih perlahan daripada DNA supercoiled.

• Borang Linear: Pecah kedua-dua helai kovalen plasmid menghasilkan DNA linear. Bentuk DNA plasmid ini mempunyai struktur berbentuk rod dan penghijrahannya lebih perlahan daripada supercoiled, tetapi lebih cepat daripada nicked.

Apabila menganalisis kualiti DNA plasmid yang digunakan untuk pembuatan vaksin plasmid DNA, pihak berkuasa kawal selia tertinggi menghendaki penyediaan terdiri daripada sekurang-kurangnya 80% plasmid dalam bentuk supercoiled.

Kepentingan Topologi Plasmid dalam Penyelidikan dan Biofarmaseutikal

Dalam DNA plasmid, bentuk isoform mempengaruhi beberapa faktor dalam proses berkaitan mengenai vaksin:

• Pemindahan kepada Sel Mamalia: Bentuk supercoiled DNA plasmid adalah yang paling berkesan dalam pemindahan sel mamalia berbanding bentuk santai dan linear.

•Pengeluaran Vaksin mRNA: Keperluan untuk templat plasmid linearisasi untuk transkripsi in vitro (IVT) menimbulkan bahan cemar plasmid bulat terbuka, menjejaskan hasil dan konsistensi.

• Pembuatan Vektor Terapi Gen: Plasmid supercoiled berkualiti tinggi adalah penting untuk pengeluaran vektor berkaitan adeno (AAV).

• Pemantauan Kestabilan: Keadaan penyimpanan dan tempoh penyimpanan menjejaskan kestabilan plasmid apabila kekerapan bentuk tercalar atau linear meningkat.

Kemajuan Penyelidikan Terkini dalam Analisis DNA Plasmid

Dua daripada kajian baru-baru ini menekankan kepentingan pemisahan resolusi tinggi DNA plasmid:

1. ZorE-Mediated Plasmid Nicking (2025)

Satu kajian yang diterbitkan dalam Nature Communications (Mac 2025) bertujuan untuk sistem pertahanan bakteria dan menunjukkan kawalan ke atas topologi plasmid. Kumpulan penyelidikan di bawah Institut Zorya menggambarkan transformasi perlahan DNA plasmid pSG483 supercoiled kepada bentuk yang dipotong dan linear oleh protein ZorE. Ini diperhatikan sebagai proses secara beransur-ansur, dan transformasi telah dianalisis secara kuantitatif menggunakan ImageJ untuk melakukan kajian densitometri. Adalah diperhatikan bahawa plasmid supercoiled secara beransur-ansur dipotong oleh ZorE (768 nM) selepas pengeraman 60 minit pada 37 °C.

[ZorE-Mediated Plasmid Nicking (2025)]

*"Tindak balas dihentikan dengan menambah EDTA dan SDS, dan produk dipisahkan menggunakan elektroforesis gel dalam penimbal 1× TAE, gel agarosa 1.4%, dan diwarnakan dengan eb."* — Komunikasi Alam Semula Jadi, 2025

Penemuan ini didapati kritikal berkenaan dengan kajian serpihan DNA dan interaksi protein yang dijalankan menggunakan sistem gel.

2. DNA bukan B dan protein pembaikan DNA (2025)

Penerbitan PNAS daripada NIH pada Januari 2025, menunjukkan bahawa memasukkan ulangan dinukleotida ke dalam plasmid pUC18 mempunyai kesan cis terhadap pengikatan protein pembaikan ketidakpadanan Mlh1-Pms1. EMSA menguji pengikatan protein pada kepekatan antara 25 nM hingga 400 nM dalam kedua-dua DNA supercoiled dan linearized. DNA bentuk bukan B mengganggu fungsi pembaikan protein dan menambah pemahaman tentang ketidakstabilan DNA.

[Protein Pembaikan DNA dan DNA Bukan B (2025)]

Pertimbangan Penting dalam Elektroforesis DNA Plasmid

Dalam elektroforesis DNA plasmid, pengoptimuman resolusi elektroforetik adalah kritikal.

Sistem Gel Mendatar HE-50: Sistem Pilihan

Yang Sistem Gel Mendatar HE-50 daripada Teknologi Longlight, menggunakan reka bentuk seragam yang bermanfaat untuk elektroforesis DNA plasmid.

1. Pemisahan berkualiti tinggi

• Elektrod Platinum Tulen 99.95%: elemen reka bentuk kritikal untuk menyelesaikan supercoiled daripada isoform yang bercabut.

• Format Gel Fleksibel: Penyelidik boleh memilih dimensi gel dengan mana-mana daripada empat saiz dulang yang tersedia: 60×60 mm, 60×120 mm, 120×60 mm dan 120×120 mm. Saiz terbesar menawarkan jarak penghijrahan yang cukup panjang untuk menggambarkan isoform yang berhijrah rapat dengan resolusi yang lebih tinggi.

2. Reka Bentuk Berorientasikan Pengguna

• Dulang Pemuatan Berpandu dengan Latar Belakang Hitam: Pembaris pendarfluor dengan latar belakang gelap membolehkan penjajaran hujung pipet dengan teliti ke telaga apabila berbilang sampel dimuatkan untuk perbandingan langsung.

• Tangki Polikarbonat Ketelusan Tinggi: Reka bentuk penglihatan tinggi dengan tangki terbina dalam menunjukkan penghijrahan bahagian hadapan pewarna dan proses elektroforesis tanpa perlu membuka tangki dan mengganggu sistem.

3. Keselamatan dan Kecekapan

• Tudung Tutup Automatik: Suis keselamatan memotong kuasa apabila penutup dibuka untuk menghapuskan bahaya eletroshock semasa pengguna memuatkan sampel atau mengeluarkan gelatin.

• Penggunaan Penampan Rendah: Ruang penghijrahan bawah menggabungkan reka bentuk jambatan yang menggunakan kurang penimbal sambil menyediakan persekitaran ionik yang mencukupi untuk melakukan elektroforesis DNA yang konsisten dan boleh dipercayai.

Langkah-langkah untuk Menganalisis Isoform Plasmid

Untuk mendapatkan pengasingan DNA plasmid yang optimum menggunakan sistem HE-50:

• Buat Gel Agarose: Pilih mana-mana daripada empat saiz dulang untuk membuang gel agarosa 0.8-1.0%. Menganalisis plasmid bersaiz antara 3 - 10 kb dengan gel agarosa penimbal 1× TAE.

• Penyediaan Sampel: Gabungkan sampel DNA plasmid dengan pewarna pemuatan. Gunakan 200 - 500 ng DNA plasmid. Nisbah sampel pewarna: memuatkan pewarna boleh menjadi 1:6, 1:3, atau 1:1.5. Menggunakan pipet, muatkan sampel pewarna plasmid ke dalam telaga agarosa.

• Elektroforesis: Gel dengan dimensi 120 x 120 mm hendaklah dijalankan pada 100 V. Untuk gel 100 x 100 mm, gunakan 80V. Bromophenol blue dibenarkan berjalan selama 45-60 minit. Elektroforesis dihentikan apabila pewarna mencapai 2/3 jalan ke bahagian bawah.

• Visualisasikan dan Dokumenkan: Penutup lutsinar yang terdedah membolehkan gel menjadi UV dan diimej semasa penutup masih berada di tempatnya. Apabila pembaris molekul hadir, pendarfluor positif diperhatikan.

• Kuantifikasi Pengedaran Isoform: Sistem dokumentasi gel automatik mengukur keamatan jalur. Peratusan DNA supercoiled ditentukan oleh yang berikut: [Keamatan SC] / (Keamatan Linear SC OC) × 100.

Penyepaduan Aliran Kerja Tanpa Halangan

Sistem HE-50 direka bentuk untuk penyepaduan tanpa halangan ke dalam aliran kerja makmal sedia ada:

• Penyepaduan Bekalan Kuasa: Palam pisang 4 mm yang diperlukan serasi dengan kebanyakan bekalan kuasa elektroforesis (kami mengesyorkan voltan malar).

• Penyepaduan Sistem Pengimejan: Tudung lutsinar UV serasi dengan sistem pengimejan dokumentasi gel standard, menghapuskan keperluan untuk memindahkan gel dari tangki ke pengimejan.

• Penggunaan Protokol: Sistem ini serasi dengan semua kepekatan gel agarosa standard, dan penimbal elektroforesis (TAE, TBE, SB), membolehkan penggunaan protokol analisis plasmid yang diterbitkan sebelum ini.

Kesimpulan

Elektroforesis DNA ialah kaedah yang paling mudah dan popular untuk menilai kualiti DNA plasmid. Penyelidik boleh menggunakan pengetahuan mereka tentang penghijrahan isoform supercoiled, nicked dan linear untuk mengoptimumkan pemisahan dan mentafsir keputusan. Sistem Gel Mendatar HE-50 menyediakan keupayaan — elektrod platinum tulen, saiz gel yang boleh dipilih, panduan pemuatan dan kawalan — penting untuk analisis plasmid rutin. Seperti yang dinyatakan dalam Nature Communications (2025) dan NIH (2025), elektroforesis gel agarosa ialah salah satu kaedah asas untuk menganalisis interaksi antara DNA dan protein serta topologi atau struktur DNA.

Sistem Gel Mendatar HE-50 mempunyai potensi untuk disepadukan sepenuhnya dan modular kepada sistem pengimejan; dengan cara ini, ia menyediakan pelanggan lebih banyak pilihan untuk sistem pengimejan DNA plasmid yang berpatutan. Untuk mengetahui lebih lanjut, sila hantar permintaan sebut harga kepada Longlight Technology.

Soalan lazim

S1. Bolehkah elektroforesis gel mendatar mengenal pasti DNA plasmid supercoiled dan tercalar?

Sistem HE-50 boleh mengenal pasti plasmid DNA supercoiled, nicked dan linear selagi keseragaman medan elektrik dicapai, dan gel agarosa 0.8-1.2% digunakan.

S2. Apakah kadar penghijrahan yang berbeza bagi pelbagai bentuk plasmid semasa elektroforesis?

Oleh kerana bentuk plasmid berbeza dari segi struktur, ia mempamerkan kadar penghijrahan yang berbeza-beza apabila tertakluk kepada elektroforesis. Sebagai contoh, bentuk plasmid linear berhijrah lebih cepat daripada bentuk bulat. DNA dalam bentuk linear mempunyai kadar penghijrahan sederhana, manakala DNA dalam bentuk bulat yang dipotong atau terbuka mempunyai kadar penghijrahan yang paling perlahan.

S3. Berapakah peratus DNA supercoiled yang dianggap berkualiti tinggi untuk pemindahan?

Bentuk supercoiled DNA plasmid yang lebih besar daripada 80% secara amnya dianggap sebagai penyediaan plasmid berkualiti tinggi untuk pemindahan dan terapi gen.

Soalan 4. Bolehkah saya menggunakan penimbal TAE dan bukannya TBE untuk mengasingkan isoform plasmid?

Ya, dalam kebanyakan kes penimbal TAE boleh digunakan untuk analisis plasmid. Walau bagaimanapun, penimbal TBE adalah optimum untuk mengasingkan isoform plasmid apabila perbezaannya minimum dan dalam pemisahan lanjutan.

Soalan 5. Mengapakah sampel plasmid saya menunjukkan berbilang jalur pada gel?

Berbilang jalur biasanya diperhatikan untuk bentuk plasmid supercoiled, nicked dan linear. Jalur lain mungkin disebabkan oleh penghadaman yang lemah atau pencemaran DNA dan RNA yang terdegradasi.