Penampan Elektroforesis Pantas: Jadikan gel sebagai titik pemeriksaan, bukan langkah menunggu

Elektroforesis gel agarosa bukanlah pengakhiran eksperimen.

Lebih kerap ia berlaku di tengah-tengah.

Anda lakukan PCR, jalankan gel dan tentukan sama ada produk PCR perlu disucikan. Anda mencerna plasmid, melihat gelang-gelang itu dan kemudian memutuskan sama ada mahu meneruskan. Anda menyediakan sampel untuk penjujukan, menjalankan satu lagi gel QC dan membuat keputusan tentang apa yang perlu diteruskan.

Inilah sebabnya duduk dan menunggu elektroforesis boleh kelihatan sangat lama. Tiada apa yang akan bergerak ke hilir sehingga anda melihat jalur itu, walaupun gel hanya boleh mengambil masa setengah jam.

Kelebihan utama penimbal elektroforesis pantas, oleh itu, adalah untuk memendekkan kitaran keputusan itu—bukan sekadar mempercepatkan migrasi DNA.

Longlight's 50X Penampan Larian Sangat Pantas ialah penimbal elektroforesis agarosa kekuatan ion rendah yang menyediakan pemisahan DNA dengan pantas. Ia biasanya boleh melakukan pemisahan biasa dalam 5-10 minit, berbanding 30 minit di bawah keadaan yang disyorkan.

Jika anda tidak pasti tentang gelang, gel lima minit tidak berbaloi.

Kelajuan sahaja bukanlah hasil yang diingini.

Jika gel itu tidak berhasil, maka ia adalah gel ulang lima minit dan bukan lagi eksperimen lima minit.

Walaupun untuk aplikasi biologi molekul biasa, seseorang perlu membezakan jalur untuk membuat keputusan seterusnya: Adakah produk yang dijangka dihasilkan dalam PCR? Adakah sisipan itu wujud? Adakah ia sesuai untuk pemulihan DNA? Ada apa-apa lagi yang anda perlu lakukan dengan sampel itu?

Penimbal yang berjalan pantas ini serasi dengan kepekatan agarosa sebanyak 0.8%, 1% dan 2% dan pemisahan jelas jalur asid nukleik dicapai dalam gel-gel ini, menurut Longlight.

Oleh itu, sasaran yang tepat bukanlah kelajuan migrasi maksimum.

Ia adalah larian minimum yang mencukupi untuk membuat keputusan.

Tetingkap voltan yang berguna diubah oleh perubahan kekuatan ion yang rendah.

Mudah untuk melihat bahawa ada had untuk meningkatkan voltan bagi menjadikan gel konvensional lebih pantas: haba.

Kebolehramalan migrasi dan bentuk jalur mungkin merosot dengan peningkatan arus dan beban terma. Penimbal yang bergerak pantas pula menangani masalah ini dari perspektif berbeza dengan mengurangkan kekuatan ionik, sekali gus mengurangkan penjanaan haba dan membolehkan medan elektrik yang lebih tinggi digunakan semasa pemisahan. Menurut Longlight, panjang gel penimbal kerja 1X adalah kira-kira 25–30 V/cm, bergantung pada geometri tangki elektroforesis dan suhu persekitaran.

Perbezaan itu penting.

"Elektroforesis pantas" tidak merujuk kepada penggunaan voltan yang lebih tinggi sehingga sesuatu berlaku.

Ia harus melibatkan penggunaan penimbal dan tetingkap operasi yang direka untuk berfungsi bersama.

Penimbal 1X dianggap sebagai sebahagian daripada Kaedah.

Stok pekat nampak seperti konsep mudah: cairkan dan habiskan.

Di sini, jalan pintas makmal kecil juga boleh memperkenalkan variasi yang tidak perlu.

Penampan pantas yang dibekalkan oleh Longlight dibekalkan sebagai pekatan 50X yang dicairkan 1:50 dalam air suling untuk menghasilkan larutan kerja 1X. Syarikat tidak mencadangkan bahawa keadaan penimbal yang berbeza harus dibuat antara gel dan tangki, dan disyorkan menggunakan batch larutan 1X yang sama untuk kedua-dua pengecoran gel dan elektroforesis. Pencairan di bawah 1X juga tidak digalakkan kerana migrasi yang tidak normal mungkin berlaku.

Setelah prosedur gel pantas berjaya, tambahkannya ke dalam SOP.

Elakkan meninggalkannya sebagai sesuatu yang "semua orang di makmal" "secara kasar tahu."

Jangan salin voltan dari tangki orang lain!

Tanpa panjang gel, nilai voltan adalah maklumat tidak lengkap.

Adalah berguna untuk memikirkan larian dari segi kekuatan medan, kerana nisbah jarak kepada masa tidak sama untuk ruang elektroforesis padat berbanding gel yang lebih panjang.

Itulah sebabnya Longlight telah menetapkan julat operasi setiap sentimeter gel. Ia juga boleh memuatkan beberapa jenis dulang seperti gel pendek, panjang, lebar dan besar, sebab itulah satu voltan yang dihafal tidak boleh dipindahkan begitu sahaja dari satu set up ke set seterusnya, dengan Sistem Gel Mendatar HE-50.

Mulakan dengan pengesahan "kekuatan medan" dan perhatikan "gel sebenar".

Suhu, reka bentuk tangki dan had bekalan kuasa masih merupakan satu eksperimen.

Elektroforesis Pantas Apabila Keputusan Mudah

Tidak semua gel mempunyai tugas yang sama.

Pemisahan analitik yang terperinci kadangkala diperlukan oleh penyelidik. Satu lagi ujian adalah untuk melihat sama ada produk PCR diperoleh pada saiz yang betul.

Yang kedua ialah kes di mana konsep elektroforesis pantas amat berguna.

Banyak masalah kecil boleh berlaku sepanjang hari bekerja dengan pengesahan PCR, saringan klon, pemeriksaan sekatan dan QC DNA perantaraan. Pos pemeriksaan itu boleh menjadi lebih pendek jika mereka berbuat demikian, yang bermakna para penyelidik boleh membuat beberapa keputusan eksperimen dalam satu petang tanpa perlu menunggu ujian konvensional berulang.

Pemeriksaan rutin ini boleh dipermudahkan lagi dengan menggunakan Penanda DNA sedia guna, kerana penanda Longlight telah dibekalkan dengan penimbal beban dan direka untuk digunakan secara langsung dalam elektroforesis agarosa.

Tujuannya BUKAN untuk menstandardkan setiap eksperimen elektroforesis.

Penting untuk memahami gel mana yang benar-benar dibina untuk menjawab pertanyaan pantas.

Proses penjimatan masa tidak diteruskan sehingga langkah seterusnya siap.

Bayangkan melakukan elektroforesis selama 8 minit dan kemudian perlu menyediakan semua perkara pada langkah seterusnya selama 20 minit lagi.

Penampan itu pantas. Aliran kerjanya tidak seperti itu.

Di mana langkah sekeliling diambil kira, elektroforesis pantas adalah kaedah terbaik. Menurut Longlight, Penimbal Berjalan Super Pantas mereka tidak akan mengganggu aliran kerja hiliran; Pengekstrakan dan ligasi gel DNA boleh dilakukan ke atas DNA yang ditemui dalam penimbal Longlight.

Jika masa penyediaan gel juga menjadi kekangan untuk makmal, maka satu lagi pilihan adalah menggunakan Gel Pratuang Agarose, yang sudah disediakan untuk dimuatkan dan tidak tertakluk kepada masa penyediaan gel tradisional.

Di sinilah beberapa penjimatan masa kecil menjadi penjimatan masa sebenar dalam kerja di bangku simpanan.

Pengimejan adalah langkah seterusnya yang memperlahankan Gel Gets Faster

Apabila satu langkah dalam proses makmal dipercepatkan, sesuatu yang biasa berlaku.

Tiba-tiba, anda sedar betapa panjangnya yang seterusnya.

Apabila pemisahan selesai dalam beberapa minit, masa untuk menanggalkan gel, memasang pencahayaan, melaraskan pendedahan, mengenal pasti tangga dan menyimpan imej mungkin merupakan peratusan yang lebih besar daripada masa pusingan keseluruhan.

Dengan pemprosesan imej terbina dalam dan anotasi penanda automatik, Longlight Sistem Pengimejan Gel GI-200 terpakai kepada makmal yang mencari aplikasi melebihi hanya masa pelaksanaan elektroforesis.

Oleh itu, adalah penting agar penampan pantas tidak dinilai secara berasingan.

Ukur tempoh aliran kerja, dari memperkenalkan sampel hingga bila anda boleh membuat keputusan seterusnya tentang eksperimen.

Kemukakan bukti bahawa penggunaan semula air adalah selamat. Berikan bukti bahawa penggunaan semula air adalah selamat.

Longlight menyatakan bahawa penimbal mempunyai penampan yang cukup untuk digunakan berkali-kali, tetapi tidak tanpa had.

Persekitaran kerja boleh berubah dengan elektroforesis berturut-turut, keadaan bilik yang hangat dan penggunaan terkumpul. Oleh itu, mengikut arahan pengeluar, penimbal yang sedang berjalan harus diganti dari semasa ke semasa untuk memastikan kebolehulangan.

Sekarang adalah masa untuk peraturan makmal yang mudah.

Tentukan bila penimbal perlu diganti, daripada tunggu sehingga "gel yang kelihatan pelik" mengingatkan anda bahawa sudah tiba masanya untuk menukarnya.

Pemeriksaan Bench Akhir

Apabila mempertimbangkan penggunaan penimbal elektroforesis pantas dalam penggunaan makmal rutin, pastikan penimbal tersebut disahkan dengan sampel yang digunakan makmal untuk memproses.

Cipta penyelesaian 1X yang sesuai. Pengecoran dan pengoperasian sepatutnya dilakukan dalam penimbal kerja yang sama. Pilih kekuatan medan berdasarkan panjang gel dan keadaan tangki. Suhu pantau. Pastikan jalur yang dihasilkan mencukupi untuk membuat keputusan.

Kemudian ukur sesuatu selain masa elektroforesis, sesuatu yang berguna:

Memuatkan sampel untuk menentukan apa yang perlu dilakukan seterusnya?

Di sinilah Elektroforesis Pantas memainkan peranannya di makmal.

Soalan lazim

S1. Apakah maksud penimbal elektroforesis pantas? Apakah istilah 'penimbal elektroforesis pantas'?

Penimbal berjalan direka untuk membolehkan pemisahan asid nukleik dalam gel agarosa dengan lebih cepat. Versi Longlight diformulasikan dengan kekuatan ionik rendah yang membolehkan kekuatan medan yang lebih tinggi dengan pengurangan penjanaan haba.

S2. Seberapa pantas elektroforesis pantas boleh berlaku? Sebaliknya, seberapa pantas elektroforesis pantas boleh berlaku?

Longlight biasanya mencapai masa pemisahan sekitar 5 - 10 minit di bawah keadaan yang disyorkan berbanding kira-kira 30 minit untuk larian pemisahan konvensional. Prestasi sebenar bergantung kepada panjang gel, reka bentuk tangki dan keadaan operasi.

S3. Apakah kepekatan buffer berjalan untuk 50X?

Pekatan dicairkan 1:50 dengan air suling untuk menghasilkan larutan kerja 1X. Sebaiknya, batch 1X yang sama digunakan untuk membuat gel dan mengisi ruang larian.

S4. Adakah perlu menggunakan penampan berlari pada kelajuan lebih tinggi sebelum pengekstrakan gel?

Menurut Longlight, Super Fast Running Buffer boleh digunakan untuk pengekstrakan dan ligasi gel DNA, membolehkan sampel digunakan dalam aplikasi hiliran standard.

S5. Bolehkah penimbal elektroforesis pantas digunakan semula?

Produk ini mempunyai kapasiti penimbal untuk digunakan semula, tetapi disyorkan agar produk tersebut diganti secara berkala untuk memastikan ketepatan dan kebolehulangan. Suhu, serta keadaan larian berulang juga perlu dipantau.