Chromatin Shearing: Cara Membina Aliran Kerja ChIP Boleh Dihasilkan Semula

Memotong kromatin adalah salah satu langkah paling sensitif dalam protokol ChIP. Fragmen yang terlalu besar boleh menyebabkan penurunan resolusi dan imunopresipitasi yang lemah. Ricih dengan intensiti yang terlalu tinggi boleh menyebabkan epitop, kompleks DNA–protein dan kerosakan bahan yang boleh dipulihkan.

Tiada satu program tunggal yang akan berfungsi untuk semua sampel. Tindak balas kromatin terhadap tenaga ultrasonik berbeza mengikut jenis sel, penetapan, bahan permulaan, dan bergantung pada kecekapan lisis kromatin serta isipadu sampel. Keseluruhan proses penyediaan harus dikawal untuk mendapatkan hasil yang boleh dipercayai, bukan hanya mengubah masa sonikasi.

Apa itu Mencukur Kromatin?

Sebelum imunopresipitasi, geseran kromatin memecahkan kromatin silang kepada serpihan DNA – protein yang lebih kecil. Antibodi kemudian boleh digunakan untuk memperkayakan kromatin yang dikaitkan dengan faktor transkripsi tertentu, histon atau pengubahsuaian histon.

Selepas imunopresipitasi, pautan silang dibalikkan, DNA dimurnikan, dan kawasan yang diperkaya dianalisis melalui qPCR atau penjujukan. Longlight's Penyelesaian ChIP-seq memberikan bantuan dalam kajian interaksi protein–DNA dan tapak pengawalseliaan seluruh genom.

Pemotongan kromatin berbeza daripada fragmentasi DNA yang dimurnikan kerana nukleosom, protein berkaitan dan pautan silang formaldehid mengubah aksesibiliti DNA dan sifat mekanikal.

Mengapa Fragmen Saiz penting?

Serpihan besar akan mengurangkan resolusi kedudukan kerana DNA yang dipulihkan mungkin jauh lebih panjang daripada tapak pengikatan protein. Ia juga mungkin menimbulkan latar belakang apabila terdapat kawasan di sekelilingnya yang tidak spesifik tetapi masih bersambung secara fizikal.

Jangan anggap bahawa kepingan yang sangat pendek semestinya lebih baik. Pemprosesan yang berlebihan boleh menyebabkan kehilangan hasil imunopresipitasi, kehilangan epitop sensitif atau profil perpustakaan yang tidak sesuai.

Saiz fragmen optimum akan berbeza berdasarkan protokol ChIP, sasaran biologi, antibodi yang digunakan dan analisis hiliran. Oleh itu, makmal harus menetapkan taburan yang boleh diterima untuk ujian mereka sendiri dan bukan hanya saiz purata sejagat.

Tentang apa Mencukur dengan Cross-Linking?

Crosslinking akan mengekalkan interaksi protein-DNA manakala cross-linking yang terlalu intensif boleh menyukarkan kromatin untuk terpecah dan mengaburkan epitop antibodi. Interaksi lemah atau sementara boleh hilang akibat penetapan yang tidak mencukupi.

Masa penetapan berbeza mengikut jenis sampel, kepekatan reagen, ketumpatan sel dan protein sasaran. Pendinginan juga mesti seragam kerana tingkah laku sampel akan berubah apabila pautan silang selanjutnya.

Jika sampel terus menahan geseran walaupun meningkatkan jumlah tenaga akustik, maka ini tidak akan menyelesaikan masalah asas. Syarat cross linking dan quenching perlu dipertimbangkan sebelum mengamalkan program yang lebih agresif.

Mengapa Input Sel Dan Lisis Penting?

Lebihan sel dalam jumlah kecil boleh menghasilkan kromatin tebal dan melekit yang akan terpotong secara tidak teratur. Bahan permulaan yang terlalu sedikit boleh meningkatkan kehilangan pengendalian dan menyukarkan penilaian kualiti kromatin.

Bilangan sel antara eksperimen harus diseimbangkan. Sampel tisu memerlukan perhatian tambahan kerana terdapat risiko tinggi untuk memperoleh lisat heterogen akibat bahan ekstraselular, perbezaan struktur dan disosiasi yang tidak lengkap.

Sebelum sonasi, pelepasan berkesan nukleus dan kromatin adalah sangat penting. Lisis yang tidak lengkap boleh menyebabkan kehadiran nukleus atau ketulan sel yang tidak terputus yang terdedah kepada tenaga dengan cara yang berbeza daripada sampel lain.

Sejauh Mana Fokus ultrasonifikasi Membantu Meningkatkan Kawalan?

Sonikator probe digunakan di mana tenaga disalurkan terus ke sampel. Variabiliti dan potensi pencemaran boleh berlaku daripada kedudukan probe, kedalaman rendaman dan teknik operator.

Ultrasonikasi fokus digunakan untuk mengarahkan tenaga akustik, melalui medium penghubung, ke dalam bekas sampel tertutup. Ini menghasilkan persekitaran pemprosesan tanpa sentuhan yang lebih terkawal.

Yang Ultrasonikator fokus BoFU-100 menyediakan pengawalan DNA, RNA dan ricih kromatin yang dikawal suhu. Sistem BoFU-1600 menawarkan pilihan aliran kerja makmal berbilang saluran apabila memproses pelbagai sampel.

Apakah Parameter yang Perlu Dioptimumkan?

Intensiti akustik, kitaran tugas, masa rawatan, bilangan kitaran, masa jeda, isipadu sampel dan suhu sampel adalah pemboleh ubah penting.

Ubah satu pembolehubah utama pada satu masa semasa pengoptimuman awal. Apabila intensiti dan tempoh dan/atau kepekatan sel berubah serentak, sukar untuk menentukan sama ada hasilnya lebih baik atau lebih buruk kerana kedua-dua perubahan tersebut.

Uji matriks kecil keadaan di sekitar titik permulaan yang munasabah dan bandingkan taburan fragmen serta pemulihan DNA

- BUKAN rawatan paling kuat yang menghasilkan DNA paling pendek!

Selepas pemilihan program, simpan program dengan input pengukuran sel, penimbal, tiub dan isipadu sampel. Tanpa syarat ini, parameter sonikasi tidak dapat dihasilkan dengan boleh dipercayai.

Kenapa Penting bahawa sampel perlu disimpan sejuk?

Rawatan ultrasonik disertai dengan kesan pemanasan dan kromatin mungkin sensitif terhadap haba. Kerosakan protein, kehilangan pengenalan antibodi dan peningkatan variasi boleh menjadi faktor haba.

Penyejukan sepanjang keseluruhan larian harus sama (walaupun semasa rehat antara larian). Kelajuan pergerakan tiub antara baldi ais dan instrumen tidak sepatutnya menjejaskan suhu sampel.

Mencukur Kualiti Semak: Bagaimana?

Selepas pemotongan, ambil aliquot wakil. Balikkan pautan silang, bersihkan DNA dan nilai keseluruhan taburan saiz fragmen dengan elektroforesis gel agarosa atau penganalisis serpihan automatik yang sesuai.

Jangan nilai kromatin silang yang tidak dirawat seolah-olah ia DNA yang telah dimurnikan. Saiz yang kelihatan boleh mengelirukan disebabkan perubahan migrasi yang disebabkan oleh protein dan pautan silang.

Kebanyakan bahan harus berada dalam had "diterima" makmal dengan sedikit atau tiada populasi besar bahan berat molekul tinggi. Jumlah DNA yang ditemui juga harus diukur kerana profil yang baik tidak bernilai jika sebahagian besar DNA telah hilang.

Kenapa ada tidak konsisten Pemotongan kromatin?

Ini disebabkan oleh fiksasi berubah-ubah, kiraan sel yang tidak tepat, lisis yang tidak lengkap, isipadu sampel berubah-ubah, jenis tiub yang berubah-ubah dan pergerakan suhu.

Buih atau gelembung udara adalah isu yang boleh menjejaskan penggandingan akustik. Oleh itu, tiub sampel mesti diisi, ditutup dan diletakkan dengan cara yang sama. Untuk pembangunan kaedah, tiub daripada jenis yang disahkan/lot yang disahkan adalah lebih disukai.

Jika terdapat variasi antara keputusan daripada satu kelompok, ini boleh menunjukkan bahawa terdapat kesan kedudukan sampel atau masa penyediaan sampel mungkin tidak konsisten. Log larian yang ringkas boleh berguna untuk melihat jika terdapat sebarang variasi berkaitan biologi, prosedur atau instrumen.

Bagaimana jenis sampel baru harus dioptimumkan?

Mulakan dengan fiksasi kecil dan matriks akustik menggunakan bahan yang mewakili eksperimen sebenar. Jangan gunakan spesimen yang bernilai atau tidak boleh diganti untuk ujian awal.

Menilai taburan fragmen serta prestasi pemulihan DNA dan imunopresipitasi. Selepas ricih, kesesuaian kromatin untuk ChIP boleh dinilai menggunakan antibodi kawalan positif dan lokus sasaran yang diketahui.

Setelah dioptimumkan, tetapkan parameter kritikal dalam SOP. Untuk maklumat lanjut mengenai ultrasound fokus untuk penyediaan kromatin, sila lihat Longlight Halaman aplikasi ChIP.

Kesimpulan

Ia bukan hanya tentang kuasa ultrasonik untuk menghasilkan ricih kromatin yang boleh dipercayai. Pelbagai komponen seperti penetapan, input sel, lisis sel, geometri sampel, serta keadaan akustik dan suhu mesti serasi.

Kaedah optimum menghasilkan taburan fragmen yang betul dan mengekalkan prestasi imunopresipitasi serta pemulihan bahan. Setiap makmal dialu-alukan untuk menghubungi Longlight melalui halaman hubungan untuk memberikan maklumat tentang jenis dan kumpulan sampel mereka serta aliran kerja ChIP yang ingin digunakan, untuk sokongan peralatan dan aplikasi.

Soalan lazim

Q1. Mengapa terdapat keperluan untuk ricih kromatin?

Ia memecahkan kromatin silang kepada kepingan yang lebih kecil untuk IP. Penggunaan fragmen bersaiz terkawal akan meningkatkan resolusi ChIP-qPCR dan ChIP-seq.

Q2. Apa yang akan berlaku jika kromatin kurang digeser?

Kepingan yang sangat besar boleh menyebabkan kehilangan resolusi dan peningkatan latar belakang tidak spesifik. Pertimbangkan untuk menilai semula penetapan, lisis dan keadaan akustik sebelum memanjangkan rawatan secara automatik.

Q3. Adakah mungkin untuk terlebih ricih kromatin?

Ya. Jika terlalu banyak rawatan digunakan, pemulihan akan terjejas atau epitop protein dan kompleks DNA–protein akan rosak. Tidak semestinya idea yang baik untuk menggunakan fragmen yang lebih pendek.

Q4. Adakah kromatin perlu disimpan di atas ais semasa sonication?

Ya. Pemprosesan suhu rendah adalah stabil, yang membantu mengurangkan kerosakan pada sampel dan protein akibat haba. Suhu harus tetap antara sampel dan kelompok.

Q5. Adakah terdapat satu kromatin sahaja?aprogram cincin yang boleh digunakan untuk semua jenis sel?

Biasanya tidak. Perbezaan antara struktur sel, ketumpatan kromatin, tindak balas penetapan dan kepekatan sampel wujud dan jenis sampel baru harus menjalani pengoptimuman terhad.