Pemisah Manik Magnetik untuk Pengekstrakan DNA: Panduan Pemilihan Praktikal

Kebanyakan tumpuan pada pengekstrakan DNA adalah pada kimia manik magnetik. Namun, pemisah yang mengandungi tiub juga boleh mempengaruhi pemulihan, ketulenan, dan konsistensi operator.

Masa tangkapan dan konsistensi zon tangkapan adalah faktor prestasi penting untuk pemisah manik magnetik yang diperlukan untuk melumpuhkan manik yang terikat pada DNA dengan cara yang cekap tanpa menjejaskan kedudukan imobilisasi manik yang boleh diramal semasa aspirasi. Dalam kes zon tangkapan yang lemah, tidak teratur dan/atau kurang kelihatan, manik mungkin hilang bersama supernatan atau mungkin tergantung dalam penimbal cucian.

Bagaimana Pengambilan DNA Manik Magnetik berfungsi?

Pengekstrakan manik magnetik melibatkan penggunaan zarah paramagnetik yang mempunyai permukaan yang mengikat asid nukleik di bawah keadaan kimia yang jelas. Selepas lisis, syarat pengikatan yang sesuai menggalakkan penjerapan asid nukleik ke atas manik magnetik yang telah difungsikan.

Medan magnet memberikan daya ke atas manik yang membawanya ke dasar atau ke arah dinding bekas sampel. Supernatan itu kemudian boleh dikeluarkan dengan pipet tanpa sentrifugasi. Sebelum DNA dielusi ke dalam penimbal elusi, garam, protein dan perencat dibasuh keluar oleh penampan cucian.

Pemisah tidak terlibat dalam ikatan kimia. Tujuannya adalah untuk melumpuhkan manik dengan boleh dipercayai semasa langkah pemisahan dan pengeluaran cecair. Rak Magnetik MSG dari Longlight ialah peranti pemisahan tiub berasaskan magnet kekal yang memisahkan asid nukleik, protein dan sel.

Mengapa Magnetik-Medan Reka bentuk penting?

Prestasi pemisah tidak boleh ditentukan hanya oleh kekuatan magnet. Jarak antara magnet dan sampel, kecerunan medan magnetik, geometri tiub dan sifat manik semuanya mempengaruhi tingkah laku tangkapan.

Medan yang baik akan menumpukan manik untuk membentuk kawasan kecil yang mudah dilihat. Ini akan memudahkan penyingkiran supernatan tanpa mengganggu pelet semasa meletakkan hujung pipet.

Corak tangkapan yang terlalu agresif atau tidak sekata boleh mengakibatkan ketulan manik yang padat yang sukar untuk digantung semula. Susunan yang buruk mungkin menyebabkan manik tergantung terlalu lama. Matlamat ideal adalah untuk memisahkan dengan cepat, teliti dan berulang tanpa menyukarkan proses pencampuran seterusnya.

apa yang Beberapa Tempat di mana DNA boleh hilang?

Kehilangan manik yang paling kerap adalah apabila supernatan dikeluarkan dan dicuci. Jika pelet tidak kelihatan, hujung pipet mungkin menggerakkannya dan/atau menyedutnya.

Masalah dengan cecair yang tinggal adalah berbeza. Penghapusan penampan cuci yang tidak lengkap boleh menyebabkan penahanan etanol, garam atau komponen lain terbawa, yang mungkin menjejaskan tindak balas PCR, ligasi atau penyediaan perpustakaan.

Adalah penting juga untuk tidak mengeringkan produk secara berlebihan. Pengeringan berlebihan manik selepas cucian akhir boleh menyukarkan untuk menggantung semula dan mungkin mengurangkan kecekapan elusi. Zon tangkapan yang jelas membimbing operator kepada penyingkiran yang betul, dan langkah seterusnya pada masa yang sesuai.

Apakah terbaik padanan untuk Format Tiub dan Volum?

Pemisah harus mengandungi bekas sebenar yang digunakan dalam protokol. Ini biasanya dalam bentuk tiub PCR, jalur 8-tiub, plat 96-telaga, tiub mikrosentrifug 1.5 mL atau 2.0 mL dan tiub kon yang lebih besar.

Lokasi tiub dalam rak mungkin terlalu jauh dari magnet untuk format lain. Penjajaran yang baik penting walaupun tiub secara fizikal boleh muat kerana penjajaran yang buruk boleh menyebabkan masa pemisahan lebih lama atau lokasi pelet yang tidak sesuai.

Jumlah kerja juga penting. Siri MSG Longlight merangkumi pelbagai format isipadu kecil dari sampel mikroliter sehingga 2 mL dalam pelbagai bekas PCR dan tiub mikrosentrifug standard.

Apakah itu Kanan jumlah throughput yang perlu dimiliki?

Makmal penyelidikan yang bekerja dengan beberapa sampel mungkin mahukan rak kecil yang sangat jelas dan mempunyai tiub yang mudah diakses. Format mesti sesuai dengan makmal diagnostik atau penjujukan serta saiz kumpulan dan protokol pipetting berbilang saluran.

Tidak menggunakan semua kedudukan tidak semestinya menjadi isu, tetapi apabila protokol lapan tiub digunakan, perbezaan masa boleh berlaku antara sampel apabila digunakan pada pengendalian individu. Penangkapan manik yang boleh diramal merentasi semua posisi adalah penting untuk kadar pengeluaran yang lebih tinggi, di mana jarak tiub yang konsisten juga penting.

Portfolio penyediaan sampel NGS Longlight merangkumi pemisahan magnetik, pengkuantitian DNA, fragmentasi DNA, dan elektroforesis, menyediakan aliran kerja yang lebih bersepadu untuk penyediaan sampel.

Mencuci – Bagaimana Adakah ia perlu dilakukan?

Selepas manik berkumpul, letakkan hujung pipet di sebelah yang bertentangan dengan manik. Biarkan cecair dikeluarkan dengan perlahan supaya tiada manik yang tercabut dari magnet.

Tambah penimbal basuhan yang ditetapkan mengikut protokol piawai. Bergantung pada aliran kerja, pencucian boleh dilakukan dengan tiub di rak atau manik perlu digantung semula sepenuhnya antara langkah pencucian.

Kaedah ini harus menunjukkan sama ada manik harus disebarkan sepenuhnya sepanjang setiap langkah. Bahan pencemar mungkin terperangkap dalam ketulan jika penangguhan semula tidak lengkap, dan boleh menyebabkan variasi yang lebih besar dalam pengendalian sampel jika pencampuran terlalu agresif.

Bagaimana DNA telah dielusi dari manik?

Setelah pencucian dan pengeringan akhir selesai (terkawal), keluarkan bekas dari rak magnetik. Tambah penimbal elusi yang ditunjukkan dan gantung semula manik dengan teliti.

Pemulihan DNA mungkin dipengaruhi oleh suhu, isipadu elusi, pencampuran dan masa inkubasi. Apabila pengelasan selesai, kembalikan tiub ke rak magnetik dan tunggu sehingga manik ditangkap semula sepenuhnya dan supernatan bersih sebelum memindahkan supernatan yang mengandungi DNA.

Kedudukan elusi pelet amat penting jika menggunakan elusi dengan isipadu rendah. Pelet padat, yang lebih jauh dari zon aspirasi, menghasilkan lebih banyak eluate yang dipulihkan, tetapi tanpa pemindahan manik.

Bagaimana boleh Pemisah Prestasi boleh diukur?

Ulangi ekstraksi dengan sampel yang sama, kimia manik dan orang yang melakukan pengekstrakan. Perhatikan masa yang diperlukan untuk pemisahan, keterlihatan pelet, kemudahan mengeluarkan supernatan dan kemudahan penangguhan semula manik.

Periksa jumlah dan kualiti DNA, serta uji aplikasi yang anda ingin gunakan DNA tersebut. Walaupun sampel mempunyai nisbah penyerapan yang boleh diterima, sampel mungkin masih mengandungi jumlah perencat yang mencukupi untuk memberi kesan kepada penyediaan PCR atau perpustakaan penjujukan.

Untuk multi-tiub dan plat, konsistensi antara posisi adalah penting. Uji lebih daripada satu lokasi ujian – bandingkan keputusan berhampiran pusat dan di tepi.

Bilakah pemisah biomagnetik yang lebih besar diperlukan?

Rak tiub boleh digunakan untuk aplikasi harian mikroliter hingga mililiter. Pemisahan ratusan mililiter atau beberapa liter reagen, biopemprosesan atau pembuatan mungkin diperlukan.

Bukanlah magnet yang lebih besar akan memberi kesan pada skala tersebut. Diameter bekas, pencampuran, jarak perjalanan bead, keseragaman medan dan pemantauan proses adalah lebih penting.

Longlight's pemisah biomagnetik, model MSG-250/MSG-1000 berguna untuk pengembangan skala bagi pemisahan asid nukleik, penulenan protein dan proses kelompok lain.

Senarai Semak Pembeli.

Sahkan perkara berikut: jenis tiub yang disokong, julat isipadu kerja, berapa banyak kedudukan, dan sama ada ia serasi dengan pipet saluran tunggal atau berbilang saluran. Lihat lokasi manik dan sama ada pelet masih kelihatan dari sudut kerja biasa operator.

Minta "data pemisahan" dalam format manik dan bekas yang serupa dengan protokol anda. Selain itu, pertimbangkan keperluan pembersihan, ketahanan kimia, kestabilan rak dan kemudahan pemasangan serta pengeluaran tiub tanpa pergerakan mendadak.

Keluarga produk yang merangkumi beberapa jilid boleh memudahkan latihan kakitangan makmal dan pemindahan kaedah untuk makmal yang menggunakan pelbagai format ekstraksi. Pemisahan magnetik dan lain-lain adalah Longlight penyelesaian aliran kerja makmal umum.

Kesimpulan

Ketepatan penyingkiran cecair basuh dan jumlah bahan pengikat DNA yang tinggal dalam tiub dipengaruhi secara langsung oleh pemisah manik magnetik untuk pengekstrakan DNA. Pelet yang kelihatan dan kedudukan tiub yang betul membantu mencapai pemulihan yang lebih tinggi dan kebolehulangan yang lebih baik dengan penangkapan manik Uniform.

Pemisah mesti dipertimbangkan bersama dengan kimia manik, isipadu sampel dan teknik pengendalian cecair. Pengguna makmal boleh menghantar e-mel format tiub dan saiz kelompok dan/atau keperluan isipadu kerja mereka kepada Longlight halaman hubungan untuk padanan produk.

Soalan lazim

Q1. Adakah pemisah magnetik mengikat DNA secara langsung atau mengikat molekul lain yang akan mengikat DNA?

Tidak. Manik-manik ini disalut dengan kimia permukaan yang mengikat dengan DNA. Pemisah dapat mengekalkan manik-manik ini dan menarik cecair di sekelilingnya.

Q2. Adakah terdapat satu rak magnetik untuk setiap jenis tiub?

Biasanya tidak. Isipadu kerja dan geometri tiub mesti diperiksa kerana kesesuaian fizikal tidak semestinya bermakna jarak yang betul dari magnet dikekalkan.

Q3. Berapa lama perlu dibenarkan untuk pemisahan magnetik?

Ia bergantung pada atribut manik, isipadu sampel, kelikatan, bentuk tiub dan reka bentuk magnet. Lakukan protokol yang disahkan, dan tunggu sehingga supernatan jelas.

S4. Mengapa manik magnetik terdapat dalam eluate akhir?

Mungkin telah mengganggu pelet semasa penyedut atau masa pembersihan terlalu singkat. Letakkan semula tiub dengan berhati-hati ke dalam magnet dan pindahkan supernatan sekali lagi.

Q5. Adakah mungkin untuk mengekstrak RNA menggunakan pemisah magnetik?

Ya, dengan prosedur kimia dan pengekstrakan manik pengikatan RNA yang sesuai. Namun, kawalan RNase mesti dilakukan.