Kit Fluorometer: Panduan Praktikal untuk Pengukuran Sampel Sensitif

Di makmal biologi molekul, DNA, RNA, atau protein boleh diukur menggunakan kit fluorometer yang menggunakan fluoresens. Ujian ini berdasarkan pewarna yang mempunyai isyarat lebih tinggi apabila terikat pada sasaran tertentu, bukannya mengukur jumlah penyerapan UV. Pemilihan ini menguntungkan jika sampel adalah cair, kecil dari segi isipadu atau tercemar dengan bahan lain yang boleh mengganggu pengukuran penyerapan.

Aliran kerja penuh biasanya merangkumi reagen ujian, penimbal pencairan, piawaian, tiub ujian atau plat ujian, dan fluorometer yang sesuai untuk prosedur tersebut. Julat ujian adalah kritikal untuk mendapatkan hasil yang boleh dipercayai, serta konsistensi penyediaan piawaian, perlindungan terhadap pendedahan cahaya yang tidak sesuai pada reagen dan semua pencairan direkodkan dengan tepat.

Kit fluorometer mengandungi semua bahan dan bekalan yang diperlukan untuk mengukur fluoresens

Majoriti kit ujian fluorometer terdiri daripada pewarna pendarfluor yang sangat pekat, penimbal ujian dan piawaian rujukan. Tiub, kad protokol atau tetapan ujian khusus instrumen juga disertakan dalam beberapa kit.

Kimia pewarna akan menjadi faktor penentu untuk apa yang akan diukur oleh ujian tersebut. Pengkuantitian dsDNA terpilih harus dilakukan pada kit DNA dua helai. Ujian RNA, DNA untai tunggal dan protein adalah berdasarkan kimia pengikatan yang berbeza dan tidak boleh ditukar ganti.

Satu contoh ialah kit komersial untuk dsDNA boleh merangkumi reagen ujian pekat, penimbal pencair dan piawaian DNA pra-cair. Sistem lain juga tersedia yang akan membekalkan reagen yang serasi dengan fluorometer tiub tunggal atau mikroplat dengan panjang gelombang eksitasi dan pelepasan yang sesuai.

Kadang-kadang, fluoresens lebih baik daripada penyerapan UV

Anggaran kepekatan asid nukleik melalui spektrofotometri UV adalah berdasarkan penyerapan pada 260 nm. Ia pantas dan berguna untuk nisbah ketulenan tetapi garam, nukleotida bebas, protein, RNA, DNA, dan sebatian organik lain boleh membawa kepada isyarat penyerapan.

Ujian pendarfluor direka untuk lebih spesifik kepada analit terpilih. Ini boleh membantu meningkatkan ketepatan kepekatan rendah atau sampel yang mungkin mengandungi pencemar berpotensi. Pengkuantitian fluorometrik boleh menjadi lebih sensitif dan selektif berbanding penyerapan UV untuk pengukuran DNA, RNA atau protein tertentu.

Kedua-dua kaedah boleh digunakan secara gabungan. Fluoresens boleh digunakan untuk mengukur kepekatan sasaran tertentu dan penyerapan UV boleh memberikan pengukuran ketulenan yang lebih umum.

Pilih kit untuk analit dan julat pengukuran.

Terdapat beberapa jenis kit fluorometer biasa yang tersedia, seperti:

• Ujian dsDNA berkepekaan tinggi
• Ujian dsDNA julat luas
• Ujian RNA
• ujian ssDNA
• Ujian protein
• Ujian kualiti RNA

Ekstrak berkepekatan rendah dan perpustakaan penjujukan yang disediakan boleh dikesan melalui ujian kepekaan tinggi. Ujian julat sempit lebih baik untuk sampel kepekatan tinggi. Sampel di luar julat yang disahkan perlu dicairkan atau keputusan mungkin kurang boleh dipercayai.

Julat pengkuantitian antara kit sensitiviti tinggi dan julat luas mungkin berbeza dan untuk analit yang sama. Oleh itu, ujian harus dipilih berdasarkan kepekatan yang dijangka, dan bukan hanya berdasarkan nama sampel.

Kit ini juga perlu serasi dengan fluorometer. Sahkan saluran pengujaan dan pelepasan, format tiub/plat, isipadu sampel, kaedah kalibrasi dan pilihan ujian yang diprogramkan. Protokol khusus boleh dipraprogramkan ke dalam sesetengah fluorometer untuk analisis dsDNA, RNA dan ssDNA, manakala yang lain boleh diprogramkan khas.

Tulis definisi untuk Sampel Volum dan Throughput

Isipadu kecil berguna jika sampel sukar diperoleh, atau memerlukan pemeliharaan untuk eksperimen hiliran. Beberapa mikroliter sampel diperlukan dalam beberapa sistem fluorometrik meja pejabat, tetapi biasanya sampel dimasukkan ke dalam jumlah larutan kerja yang lebih besar.

Kadar pengeluaran juga merupakan faktor penting. Untuk ukuran sekali-sekala dan kelompok kecil, satu tiub fluorometer mungkin sesuai. Instrumen atau aliran kerja mikroplat yang boleh memproses pelbagai sampel ekstraksi atau pelbagai perpustakaan penjujukan mungkin lebih digemari untuk makmal yang mempunyai banyak sampel.

Tidak semua alat muzik adalah yang paling praktikal. Sistem yang baik harus meminimumkan pipet berulang, memudahkan penyediaan secara berkala dan memadankan jumlah sampel sebenar yang akan dikendalikan oleh makmal secara berkala.

Untuk mengikuti aliran kerja ujian yang konsisten

Berikut adalah protokol standard kit fluorometer:

• A. Penyelesaian yang berfungsi telah disediakan. Satu penyelesaian yang berkesan telah dihasilkan.
• Menetapkan piawaian yang diperlukan
• Menambah setiap sampel tidak diketahui
• Mencampur sampel dan piawaian dengan teliti
• Inkubasi untuk masa yang ditetapkan
• Mencegah reaksi daripada pendedahan cahaya yang tidak sesuai
• Menggunakan pembaris untuk mengukur lebar dan panjang otak.9. Pengukuran otak yang betul menggunakan pembaris.
• Penggunaan faktor pencairan sampel

Gunakan pipet yang dikalibrasi untuk menyediakan dan menggunakan piawaian serta sampel dengan cara yang sama. Jika langkah pipet dilakukan dengan isipadu rendah, kesilapan kecil dalam isipadu boleh memberi perbezaan ketara pada kepekatan akhir.

Masa yang diperlukan untuk inkubasi juga penting. Mengambil satu sampel pada permulaan, dan satu lagi jauh kemudian, boleh menyebabkan variasi yang tidak perlu. Sesetengah ujian juga sensitif terhadap perbezaan suhu antara piawaian dan sampel.

Gunakan piawaian, kosong dan replikasi dengan sewajarnya

Standard digunakan untuk mengaitkan jumlah analit dengan intensiti fluoresens. Ia harus dicampur dengan teliti, dilabel dengan betul, dan dijauhkan daripada pencemaran.

Apabila sampel yang tidak diketahui dimasukkan ke dalam ruang kosong, isyarat yang diukur adalah disebabkan oleh reagen, penimbal, tiub atau matriks sampel latar belakang. Pengukuran replikasi berguna jika sampel itu bernilai, kepekatan tepat hampir dengan had ujian atau keputusan yang tidak dijangka akan menjejaskan proses hiliran yang mahal.

Jika terdapat bacaan berganda yang tidak sepadan, jangan hanya mengira purata kedua-dua bacaan tersebut. Sahkan ketepatan pipeting, pencampuran sampel, kehadiran gelembung, kebersihan tiub, masa inkubasi, suhu dan julat pengukuran yang dipilih.

Lelaki dan wanita mempunyai cara yang berbeza untuk mengukur kesakitan

Beberapa sebab biasa keputusan fluorometrik yang tidak boleh dipercayai adalah:

• Pemilihan ujian yang salah untuk sasaran
• Memilih julat sensitiviti yang tidak sesuai
• Tidak menggunakan bekas yang betul untuk penyimpanan dan penyediaan
• Menambah isipadu sampel yang tidak konsisten
• Kehadiran pencemar dalam piawaian atau larutan kerja.
• Perangkap untuk meninggalkan gelembung dalam laluan optik.
• Penggunaan tiub yang tercalar atau tidak serasi adalah dilarang. Tiub yang tercalar atau tidak serasi tidak dibenarkan.
• Pendedahan berlebihan kepada reagen sensitif cahaya
• Jangan anggap bahawa bilangan sel dalam spesimen akan berkurang melalui pencairan.
• Penggunaan peranti di luar julat peranti yang telah disahkan.

Sampel pekat juga boleh mencemarkan pipet atau kawasan kerja, dan memberi kesan kepada sampel berkesemburan rendah pada masa hadapan. Ini diminimumkan dengan hujung baru, permukaan kerja yang bersih dan urutan sampel yang rasional.

Sambungkan Pengukuran ke Aliran Kerja Hiliran dengan menyeretnya ke Aliran Kerja Hiliran

Kit fluorometer sering digunakan sebelum PCR, qPCR, kloning, penyediaan perpustakaan penjujukan, elektroforesis, transfeksi dan aliran kerja lain yang melibatkan input sampel terkawal.

Pengkuantitian penting untuk menormalkan sampel, membandingkan hasil ekstraksi, dan mendapatkan input tindak balas yang konsisten. Ujian RNA (berasaskan fluoresens) digunakan lebih awal daripada aplikasi lain seperti RT-PCR dan penyediaan perpustakaan cDNA; Pengkuantitian DNA digunakan dalam pelbagai aplikasi hiliran seperti PCR, kloning, transfeksi, dan penjujukan generasi seterusnya.

Oleh itu, pemilihan kit harus disesuaikan dengan keputusan yang dibuat selepas pengukuran. Ujian julat luas boleh digunakan semasa pemeriksaan ekstraksi rutin, dan ujian yang lebih sensitif untuk kerja penjujukan input rendah.

Sentiasa simpan dan kendalikan reagen dengan betul

Reagen pendarfluor mungkin sensitif terhadap cahaya, suhu dan pengendalian. Simpan, panaskan, gaul dan tamat tempoh mengikut arahan kit. Tidak semua pewarna pendarfluor boleh dibekukan, disimpan pada suhu bilik atau terdedah kepada cahaya makmal.

Tandakan dengan jelas penyelesaian yang berfungsi dan ingat untuk merekodkan tarikh ia dihasilkan. Sebelum mengesyaki bahawa sampel asal telah berubah, periksa umur reagen, sejarah penyimpanan reagen, piawaian, pipet, tetapan instrumen, suhu dan keserasian tiub.

Kesimpulan

Kit fluorometer adalah sensitif dan selektif untuk mengesan pengkuantitian DNA, RNA, atau protein, terutamanya dalam sampel yang bernilai atau yang cair. Pengukuran yang boleh dipercayai memerlukan ujian sesuai dengan julat analit dan kepekatan, penggunaan fluorometer yang sesuai, penyediaan piawaian yang konsisten, dan kawalan keseluruhan proses.

Bukan kit dengan had pengesanan terendah yang dinyatakan adalah kit terbaik. Ia adalah yang sepadan dengan jenis sampel, kapasiti, aplikasi hiliran dan keperluan kawalan kualiti makmal.

Soalan Lazim

S1. Apakah aplikasi Kit Fluorometer?

Terdapat beberapa kit berbeza yang tersedia untuk ujian kualiti dsDNA, ssDNA, RNA dan beberapa ujian kualiti RNA. Kimia kaedah yang digunakan untuk menapis harus sesuai dengan sasaran.

S2. Yang mana lebih berkesan, Kit Fluorometer atau kaedah UV?

Mereka cenderung lebih spesifik dan sensitif terhadap analit tertentu. Penyerapan UV masih boleh dianggap sah untuk ujian ketulenan separuh akhir dan untuk mengukur ketulenan keseluruhan sampel.

S3. Berapa banyak sampel yang anda perlukan?

Isipadu akan berbeza untuk setiap ujian dan instrumen! Memang, terdapat banyak sistem meja yang tersedia, hanya memerlukan beberapa mikroliter sampel asal.

S4. Apakah reagen yang digunakan untuk ujian DNA RNA?

Biasanya bukan secara terpilih. Dalam aplikasi rutin, seseorang mungkin ingin mengukur kandungan DNA dan/atau RNA, jadi ujian mungkin khusus untuk satu kepada satu atau kedua-duanya.

S5. Apakah punca variasi hasil daripada replikasi yang berbeza?

Ini sering disebabkan oleh ralat pipeting, pencampuran yang tidak mencukupi, gelembung, pencemaran, suhu atau julat kesilapan pengukuran.