Pengganggu Ultrasonik Boleh Aturcara: Membina Aliran Kerja Sonikasi Berulang

Apabila makmal memerlukan kawalan lebih daripada yang tersedia dengan homogenizer genggam, disruptor ultrasonik boleh aturcara mungkin jawapannya. Boleh mengganggu sel, menyebarkan zarah, menghomogenkan suspensi, memotong asid nukleik atau penyediaan sampel untuk analisis lanjut.

Alat muzik ini mudah digunakan. Cabarannya adalah untuk mencari keadaan yang membolehkan sampel diproses dengan betul tanpa kerosakan berlaku pada bahan yang ingin dipulihkan oleh makmal, dan tanpa kepanasan berlebihan pada sampel.

Di sinilah kawalan boleh diprogram sangat berguna. Pengendali boleh menetapkan amplitud dan/atau masa pemprosesan, kitaran denyutan, suhu had atau jumlah tenaga tanpa menekan butang dan tanpa menilai hasil berdasarkan bunyi. Selepas kaedah yang dioptimumkan telah ditetapkan, syarat yang dioptimumkan boleh diulang untuk sampel seterusnya.

Bagaimana Gangguan Ultrasonik Berfungsi

Pengganggu ultrasonik ialah alat yang menukar kuasa elektrik kepada getaran mekanikal. Getaran itu disalurkan kepada probe yang diletakkan dalam sampel cecair oleh penukar.

Apabila probe bergerak pada kelajuan tinggi dalam cecair, perubahan tekanan dihasilkan yang menyebabkan pembentukan gelembung cecair mikroskopik. Buih-buih ini membesar dan mengecil dan dipanggil kavitasi. Daya yang dihasilkan di kawasan setempat boleh menyebabkan membran sel terganggu, agregat dipecahkan dan membolehkan pencampuran atau penyebaran yang lebih baik.

Dari segi kegunaan praktikal, probe ini memberikan tenaga mekanikal yang sangat besar pada kawasan kecil. Inilah sebabnya sonikasi probe boleh menjadi pantas, tetapi juga boleh memudaratkan sasaran sensitif, atau menyebabkan buih dalam eksperimen.

Mengapa Kawalan Boleh Diatur Penting

Dua sampel mungkin dirawat untuk tempoh yang sama, tetapi tidak menerima rawatan yang sama.

Pergerakan tenaga ultrasonik melalui cecair akan dipengaruhi oleh: isipadu sampel, kelikatan, suhu, diameter probe, kedalaman rendaman dan bentuk bekas. Instrumen boleh atur cara membolehkan operator mengawal pembolehubah yang boleh distandardkan secara realistik.

Pemproses ultrasonik moden boleh mempunyai amplitud boleh laras, operasi berjadual, mod denyutan, paparan tenaga, titik tetapan tenaga dan pemantauan suhu.

Fungsi-fungsi ini bukan sahaja mudah tetapi juga berguna. Mereka memudahkan pendokumentasian kaedah dan menerangkan dengan tepat bagaimana sampel diproses.

Kaedah berikut: "disonikasi selama satu minit." adalah kaedah yang tidak mencukupi. Ia harus menyatakan jenis probe, tetapan amplitud, kitaran denyutan, jumlah masa pemprosesan, isipadu sampel, kaedah kawalan suhu, dan jenis bekas.

Gunakan amplitud permulaan, bukan watt maksimum

Mungkin kesilapan terbesar adalah berfikir bahawa lebih banyak watt = lebih banyak kuasa ke dalam setiap sampel.

Amplitud adalah ukuran pergerakan hujung probe, dan lebih langsung dikaitkan dengan intensiti sonifikasi. Kuasa yang digunakan oleh instrumen akan berbeza bergantung pada rintangan yang dijana oleh sampel, probe, kelikatan dan keadaan operasi. Apabila sesuatu kaedah perlu dihasilkan semula, adalah penting untuk mengekalkan amplitud, suhu, kelikatan dan isipadu sampel yang sama, kata Sonics.

Apabila membangunkan kaedah, mulakan dengan amplitud sederhana dan jangan gunakan amplitud tertinggi pada mulanya. Jalankan sampel ujian kecil, lihat keputusan dan hanya tingkatkan intensiti proses jika perlu.

Sonikasi yang berlebihan boleh menyebabkan gangguan sel yang lebih baik, tetapi juga menyebabkan suhu yang lebih tinggi, berbuih, haus probe dan kerosakan pada protein sensitif atau struktur sel.

Amplitud yang sesuai bergantung kepada aplikasi. Lisis sel dan/atau penyebaran nanopartikel, penyediaan organel dan/atau ricih DNA tidak sepatutnya dijangka sama.

Kawal haba dengan Mod Denyutan

Dengan sonikasi berterusan, suhu sampel boleh dinaikkan dengan cepat. Ini penting apabila menggunakan protein, enzim, struktur membran atau bahan sensitif suhu lain.

Kaedah mekanikal gangguan sel boleh menghasilkan pemanasan setempat, yang boleh mengakibatkan denaturasi atau pengagregatan protein. Oleh itu, pemeliharaan kualiti sampel adalah penting jika kualiti protein perlu dipelihara, dan untuk tujuan ini sampel harus disimpan dalam keadaan sejuk.

Mod denyutan adalah kitaran antara sonikasi dan relaksasi. Dalam kitaran mati, sampel diberi masa untuk menyejuk dan mengendap di sekitar probe sebelum letupan seterusnya. Operasi berselang-seli juga disebut dalam manual peralatan untuk membantu mengurangkan pengumpulan haba dan seterusnya meningkatkan konsistensi dalam pemprosesan.

Mod denyutan tidak akan menghapuskan keperluan kawalan suhu. Walaupun tiubnya kecil, ia boleh memanas dengan cepat, terutamanya pada amplitud tinggi. Masih mungkin perlu menggunakan mandian ais, pemegang sejuk, probe suhu atau pemotongan suhu yang diprogramkan.

Pastikan Probe sepadan dengan Isipadu Sampel

Terdapat pengaruh yang ketara daripada jenis probe yang digunakan.

Mikrotip kecil mengumpul kuasa dalam unsur kecil yang boleh menjadi intensiti tinggi di satu titik kecil. Semakin banyak kuasa yang anda ada, semakin banyak bahan, semakin besar probe tersebut. Seperti yang dilihat daripada arahan pengeluar, diameter probe dan isipadu pemprosesan sebenar sangat berkorelasi tetapi julat akhir nilai bergantung kepada proses.

Probe yang terlalu besar untuk sampel kecil boleh terpercik dan/atau terlalu panas. Hujung kecil dalam bekas besar boleh menyebabkan pemprosesan yang tidak sekata dan mempunyai masa pemprosesan yang terlalu lama.

Probe harus cukup dalam untuk memindahkan tenaga ke dalam cecair dengan cekap tetapi tidak terlalu dalam sehingga menyedut terlalu banyak udara ke dalam sampel cecair. Semasa getaran, ia tidak sepatutnya bersentuhan dengan bahagian bawah atau sisi bekas.

Bentuk bekas juga penting. Jika bekas sempit digunakan untuk memfokuskan tenaga, ia boleh memfokuskan tenaga secara berbeza daripada beaker lebar dan menggunakan tiub atau bekas yang berbeza dalam kajian yang sama boleh mengubah hasil, walaupun tetapan instrumen adalah sama.

Bina kaedah berdasarkan sampel – CSTA 2014, seksyen 2, gred 12, strand b, tugas 3

Biasanya, kaedah sonikasi yang boleh dibunyikan ditemui selepas beberapa percubaan singkat.

Mulakan dengan jenis sampel sebenar, saiz sampel, kepekatan, penimbal dan bekas yang bertujuan digunakan untuk analisis rutin. Sampel mesti disimpan sejuk; Pilih probe yang sesuai. Gunakan amplitud sederhana dan denyutan pendek.

Semak hasil setiap ujian menggunakan kaedah yang mensimulasikan matlamat sebenar. Ini boleh berupa mikroskopi, hasil protein, aktiviti enzim, kelikatan dan/atau penjelasan selepas sentrifugasi. Ia mungkin termasuk pengukuran saiz zarah dan/atau kestabilan visual untuk penyebaran zarah.

Jangan nilai kejayaan berdasarkan tahap kekeruhan atau kejelasan sampel. Kehilangan aktiviti protein sasaran mungkin berlaku sebelum kemunculan sampel.

Selepas syarat yang boleh diterima ditentukan, dokumentasikan syarat-syarat tersebut dengan teliti dan ulangi ujian menggunakan beberapa sampel bebas. Tiada cara yang lebih baik untuk menguji kebolehpercayaan sesuatu kaedah selain membiarkan ia berulang.

Bahan biasa yang digunakan di makmal

Jenis pengganggu ultrasonik boleh atur cara ini digunakan secara meluas dalam bidang berikut:

• Gangguan dinding sel bakteria dan mamalia. Kerosakan dinding sel bakteria dan mamalia.
• Pemotongan awal tisu perlu diikuti dengan homogenisasi tisu. Tisu harus dihomogenkan selepas pemotongan awal.
• Ini merangkumi prosedur yang diperlukan untuk menyediakan sampel protein dan asid nukleik. Penyediaan sampel protein dan asid nukleik.
• Pemotongan kromatin melalui DNA atau pemotongan kromatin. Pemotongan DNA atau kromatin.
• Penyebaran zarah dan nanozarah.
• Pengemulsian
• Deaglomerasi
• Pengekstrakan dan pencampuran
• Kesukaran dalam menyediakan penggantungan. Kesukaran untuk membuat penggantungan yang sukar.

Terdapat beberapa kaedah fizikal berbeza yang boleh digunakan untuk lisis sel, seperti sonasi. Pendekatan yang paling sesuai akan berbeza mengikut jenis sel, saiz sampel, aplikasi hiliran dan kepekaan bahan yang hendak diekstrak.

Jika pemprosesan intensiti rendah atau teknik gangguan lain lebih sesuai untuk organel halus atau protein yang mudah dimusnahkan, gunakan teknik tersebut.

Terdapat masalah operasi biasa yang perlu dielakkan

Buih biasanya disebabkan oleh probe yang terlalu dekat dengan permukaan cecair dan/atau sampel diproses dengan terlalu intensif. Penurunan kecil probe, pengurangan amplitud atau perubahan kitaran denyutan boleh membantu.

Punca gangguan yang lemah adalah amplitud terlalu rendah, probe yang salah digunakan, terlalu banyak sampel digunakan, sampel tidak direndam pada kedalaman yang betul, atau masa pemprosesan keseluruhan terlalu singkat.

Kadang-kadang beberapa pembolehubah diubah sehingga hasilnya tidak konsisten. Kaedah boleh berbeza bergantung pada tiub yang digunakan, suhu permulaan sampel, kelikatan, kedalaman penembusan probe ke dalam sampel, dan isipadu.

Apabila bunyi mekanikal kedengaran atau pelik, ia tidak harus diabaikan. Ia boleh menjadi tanda probe longgar, hujung probe rosak atau salah pemasangan. Instrumen harus dihentikan dan diperiksa sebelum pemprosesan lanjut dilakukan.

Hujung probe juga terhakis oleh hakisan kavitasi. Jika permukaan rosak, pemindahan tenaga akan berlaku dan zarah logam boleh dimasukkan ke dalam sampel. Periksa probe dengan kerap dan ganti mengikut arahan pengeluar.

Bekerja dengan Selamat

Gunakan penyangga dan pengapit yang betul untuk mengunci penukar, jangan buat pemasangan yang tidak stabil.

Walau bagaimanapun, pemproses ultrasound akan menghasilkan bunyi yang boleh didengar dan garis panduan pengeluar mengesyorkan perlindungan pendengaran apabila digunakan. Penutup bunyi akan mengurangkan pendedahan dan juga mengandungi percikan atau aerosol.

Mengendalikan dan mengandungi bahan biologi dengan betul serta mengikuti prosedur keselamatan makmal. Kawalan kedalaman probe harus dilakukan untuk meminimumkan pembentukan aerosol dan buih. Bilas antara sampel dan dekontaminasi probe dengan prosedur bilasan yang sesuai dan berkesan untuk kedua-dua probe dan sampel.

Kesimpulan

Keputusan dipengaruhi oleh amplitud, kitaran denyutan, saiz probe, isipadu sampel, suhu, kedalaman sampel ke dalam bekas, dan bentuk bekas. Rentak paling sukar bukanlah tempat yang baik untuk bermula.

Aliran kerja yang boleh dipercayai bermula dengan ujian ringkas yang terkawal dengan baik, kemudian diteruskan ke ujian hiliran yang betul untuk menilai hasil, dan kemudian maklumat yang mencukupi dikumpul supaya ia boleh diulang oleh operator lain.

Soalan Lazim

S1. Untuk apa digunakan Disruptor Ultrasonik Boleh Aturcara?

Untuk lisis sel, penghomogenan, penyebaran zarah, DNA pemotongan, emulsi, pengekstrakan dan pelbagai aplikasi untuk pemprosesan cecair.

S2. Amplitud Lebih Tinggi yang Lebih Baik?

Tidak. Peningkatan amplitud akan meningkatkan intensiti sonasi, namun boleh mengakibatkan peningkatan pemanasan, buih, kehausan probe dan kerosakan sampel.

S3. Mengapa Mod Pulse digunakan?

Mod denyutan: Tempoh rehat antara letupan ultrasonik. Ini akan membantu mengurangkan pengumpulan haba dan mengembalikan bahan ke sekeliling probe.

S4. Apakah saiz optimum probe?

Isipadu, saiz bekas sampel dan intensiti pemprosesan yang diperlukan harus dipadankan oleh probe. Hujung kecil bagus untuk isipadu kecil dan probe besar bagus untuk isipadu besar.

S5. Bagaimana untuk menjadikan hasil sonikasi boleh dihasilkan semula?

Probe, amplitud, kitaran denyutan, isipadu, suhu, kedalaman rendaman, komposisi sampel.