Sistem Pengimejan Biologi Molekul: Memilih Platform Yang Sesuai untuk Gel dan Blots

Sistem pengimejan biologi molekul menyediakan output digital gel atau membran yang boleh dilihat, diukur, disimpan dan dibandingkan. Ia boleh disediakan untuk mengimbas gel yang mengandungi DNA dan RNA, gel protein berwarna, tompok Western kimia luminesen, tompok pendarfluor, dan sampel kolorimetri.

Sistem sepatutnya digunakan untuk menyesuaikan dengan ujian dan bukan sebaliknya.

Bagaimana Sistem Pengimejan Biologi Molekul berfungsi?

Sistem pengimejan standard akan merangkumi ruang kedap cahaya, kamera, lensa, pentas sampel, sumber cahaya yang boleh digunakan untuk rangsangan yang dikehendaki, penapis yang membolehkannya melepasi hanya cahaya dengan frekuensi pelepasan tertentu, perisian untuk kamera merakam imej, dan perisian untuk menganalisis imej.

Dalam kes gel asid nukleik, alat ini menyinari cahaya UV, biru atau cahaya lain yang sesuai pada pewarna pendarfluor. Cahaya putih sering digunakan untuk gel protein yang kelihatan. Cahaya yang dihasilkan dalam tompok Barat kimia luminesen adalah hasil ciptaan sendiri dan datang daripada tindak balas kimia, jadi terdapat keperluan untuk kamera sensitif dan ruang pengimejan gelap, tetapi bukan intensiti cahaya yang tinggi pada sampel.

Sesetengah platform semua-dalam-satu mempunyai keupayaan dokumentasi gel, pengimejan kolorimetrik, kemimiminesens dan fluoresens dalam satu penutup. Sebagai contoh, bio-Rad menyediakan sistem untuk mengimej gel asid nukleik dan protein serta tompok kimiluminesen, dan sistem ini boleh diperluaskan dengan saluran yang boleh dilihat, merah jauh, dan saluran fluoresen inframerah hampir.

Anda boleh mulakan dengan sampel yang anda jalankan

Tempat pertama untuk bermula adalah di meja makmal--bukan pada helaian spesifikasi!

Untuk makmal pengajaran yang memberi tumpuan utama kepada gel agarosa, UV, cahaya biru dan pengimejan cahaya putih mungkin satu-satunya jenis yang diperlukan. Makmal penyelidikan protein yang tepat memerlukan chemiluminescence yang halus dan beberapa saluran fluoresen.

Thermo Fisher membahagikan sistem visualisasinya kepada yang menyediakan visualisasi ringkas dan yang menyediakan analisis perisian serta pengimejan Western blot dan pendarfluor berbilang saluran. Satu peringatan yang berguna: sistem dokumentasi gel tidak semestinya merupakan tahap instrumen seperti pengimej molekul multimode.

Padankan sumber rangsangan dan penapis dengan pewarna

Setiap pewarna pendarfluor mempunyai julat panjang gelombang optimum untuk pencahayaan dan pancaran cahaya. Sistem pengimejan mesti dilengkapi dengan sumber cahaya yang sesuai untuk merangsang pewarna, serta penapis pancaran yang membolehkan foton pancaran (fluoresens) sampai ke kamera sambil menolak cahaya yang digunakan untuk merangsang pewarna.

Berikut adalah contoh sistem yang boleh mengandungi:

• Pencahayaan UV
• Transiluminasi cahaya biru
• Cahaya putih yang ditransmisikan
• Cahaya putih yang dipantulkan
• Pengujaan pendarfluor yang kelihatan
• Pengujaan fluoresen inframerah dekat

Tiada kaitan antara bilangan sumber cahaya dan kualitinya. Kuncinya ialah sama ada panjang gelombang dan penapis yang dipasang serasi dengan pewarna, antibodi dan label pendarfluor yang sudah digunakan di makmal.

Semak senarai reagen untuk makmal sebelum membeli sistem untuk memastikan ia disokong oleh aplikasi. Sila ambil maklum bahawa tidak semua pewarna pendarfluor boleh dirakam kerana sistem ini dirujuk sebagai "pengimejan pendarfluor.

Kemiluminesens dan Fluoresens, sangat serupa

Dalam kemimiluminesen western bloting, cahaya dihasilkan oleh tindak balas kemiluminesen yang biasanya berasaskan antibodi-enzim dan substrat luminesen. Isyarat akan berubah mengikut masa – pengimejan harus dimulakan dalam julat masa kerja yang disyorkan untuk reagen.

Western blotting yang dilakukan oleh pendarfluor memerlukan cahaya luaran daripada eksitasi tersebut. Ia boleh digunakan untuk eksperimen multipleks, jadi pelbagai sasaran boleh dikesan pada membran yang sama melalui saluran pendarfluor yang berbeza.

Kemiluminesens biasanya digunakan untuk pengesanan sensitif dan rutin. Apabila multiplexing atau penangkapan isyarat stabil atau perbandingan kuantitatif adalah penting, fluoresens sering dipilih. Tiada satu kaedah terbaik, kerana ia bergantung kepada keperluan ujian, jumlah sasaran, antibodi, label yang digunakan dan matlamat analisis.

Jika makmal menjalankan kedua-dua ujian secara rutin, ia harus memastikan sistem yang dicadangkan membenarkan ujian dijalankan sama ada tanpa perubahan perkakasan yang kompleks.

Semasa mengambil gambar, pertimbangkan julat dinamik dan ketepuan

Sesetengah blot mungkin mempunyai satu jalur yang sangat kuat, dan beberapa jalur lemah. Jalur kuat mungkin menjadi tepu jika pendedahan cukup lama untuk menunjukkan isyarat samar.

Apabila terdapat terlalu banyak cahaya sehingga piksel kamera tidak dapat menangkap lagi. Selepas itu, kejelasan nyata jalur yang dipaparkan akan dikekalkan tetapi tahap intensiti tidak akan dapat digunakan untuk perbandingan kuantitatif.

Julat dinamik adalah julat isyarat lemah hingga kuat yang dapat direkodkan oleh sistem pengimejan dalam satu imej. Julat dinamik yang lebih besar membolehkan rakaman jalur yang samar dan intens dengan lebih mudah tanpa kehilangan sebarang maklumat.

Sesetengah platform pengimejan boleh mengesan piksel tepu, mencadangkan pendedahan yang sesuai atau menggunakan pendedahan berganda. Ia boleh mengurangkan bilangan pengimejan cuba dan salah, tetapi tidak bertujuan untuk menggantikan reka bentuk eksperimen yang baik. Walaupun sampel terlebih beban, ia masih perlu diperbetulkan semasa fasa ujian dan isyarat antibodi yang terlalu kuat juga harus diperbetulkan.

Penggunaan Pendedahan Automatik harus dielakkan

Pendedahan automatik boleh berguna jika beberapa individu bergilir-gilir menggunakan instrumen, atau jika terdapat faktor yang mungkin menyukarkan kekuatan isyarat untuk diukur.

Sesetengah sistem akan mendapatkan pendedahan awal yang singkat dan kemudian mencadangkan pendedahan keseluruhan berdasarkan itu. Sumber cahaya, fokus dan tetapan aplikasi dipilih secara automatik oleh orang lain.

Ini mungkin membolehkan pengimejan rutin menjadi lebih pantas, tetapi sila periksa oleh operator. Semak sama ada:

• Nota: Ketepuan ditunjukkan untuk jalur penting.
• Jalur lemah boleh dilihat di atas latar belakang
• Keseluruhan medan pandangan diliputi oleh sampel lengkap.
• Untuk hasil terbaik, mod pengimejan yang betul digunakan.
• Penapis dan dulang yang diperlukan digunakan
• Berikut adalah analisis kuantitatif dan memerlukan tuntutan pendedahan:

Tetapan automatik adalah titik permulaan yang baik, tetapi BUKAN alasan untuk tidak memeriksa imej.

Pastikan resolusi, sensitiviti dan medan pandangan semuanya betul

Resolusi penting untuk imej yang dirakam oleh kamera, tetapi bilangan megapiksel bukanlah penunjuk kualiti imej kamera.

Ia juga penting untuk mempunyai sistem yang berguna yang cukup sensitif, mempunyai latar belakang yang rendah, optik yang baik, seragam dan mempunyai medan pandangan yang cukup luas untuk menampung gel atau membran yang digunakan di makmal.

Jika isyarat kimia luminesen lemah, kamera yang sangat sensitif diperlukan. Semakin jauh jarak antara jalur, semakin kurang resolusi diperlukan; semakin kecil jarak antara jalur dan semakin penting untuk mempunyai resolusi, dan semakin kecil ciri dalam sampel yang akan dipisahkan, semakin banyak resolusi diperlukan.

Letakkan dulang gel makmal yang paling besar, blot atau dulang multi-gel di tapak pengimejan sebelum membeli. Jika gel besar dipotong menjadi beberapa imej, usaha akan terbuang dan perbandingan akan menjadi lebih sukar.

Pastikan imej diperoleh secara konsisten

Adalah disyorkan untuk mengambil imej dalam keadaan yang sama semasa membandingkan imej.

Tulis mod pengimejan, jenis sumber cahaya, penapis, masa pendedahan, binned, fokus, kedudukan sampel, tetapan analisis, dan latar belakang serta sebarang pembetulan latar belakang. Jika perlu, gunakan semula protokol yang telah disimpan.

Jika mewarnakan atau menghilangkan pewarnaan, pastikan keadaan adalah sama untuk gel asid nukleik dan protein. Kawal pemuatan sampel kawalan, kepekatan antibodi, masa substrat dan pengendalian membran dalam Western blots.

Pengimej hanya boleh merakam sampel yang dimasukkan. Ia tidak dapat membaiki pemindahan yang tidak sekata, latar belakang yang terlalu banyak, lorong yang terlebih beban atau kekurangan spesifikasi antibodi.

Uji Perisian Analisis

Tugasan biasa tidak sepatutnya sukar dilakukan dengan perisian analisis imej, dan perisian tidak sepatutnya mengaburkan hasil penghasilan.

Beberapa fungsi menarik mungkin:

• Pengesanan lorong & jalur
• Anggaran berat molekul
• Penolakan latar belakang
• Pengukuran intensiti jalur
• Amaran ketepuan
• Penormalan
• Paparan saluran multiplex
• Anotasi imej
• Eksport data
• Apabila pengguna atau eksperimen direkodkan.

Analisis terbina dalam adalah kelebihan untuk kerja rutin, dan perisian desktop mungkin lebih sesuai untuk analisis terperinci serta penyediaan angka akhir. Sebagai contoh, sistem pengimejan thermo fisher menawarkan pemerolehan dan analisis di atas kapal, serta aliran kerja perisian luaran.

Kekalkan fail imej asal seperti biasa selama yang anda boleh. Untuk melaraskan imej yang dipaparkan tidak sepatutnya menggantikan data pemerolehan mentah.

Pastikan anda mengambil langkah berjaga-jaga dan mengambil langkah tambahan untuk memastikan sampel anda selamat

Adalah penting untuk menyediakan perlindungan yang sesuai kerana cahaya ultraviolet langsung atau pantulan yang dipancarkan oleh peranti pengimejan UV boleh menyebabkan kerosakan pada mata dan kulit. Pendedahan boleh dikurangkan dengan menutup ruang pengimejan yang kurang berbanding kotak cahaya UV yang terbuka.

Jika DNA hendak diekstrak daripada gel, penggunaan rangsangan cahaya biru mungkin lebih baik untuk pewarnaan asid nukleik yang sesuai. Pengimejan cahaya putih menghapuskan penggunaan UV untuk melihat kesan protein yang kelihatan.

Sistem ini juga harus direka untuk memastikan pencemaran sampel ke sampel dapat dicegah. Basuh dulang sampel, singkirkan tumpahan penimbal secepat mungkin dan ikut garis panduan pengeluar untuk pembersihan penapis, lensa, dan permukaan imej.

Pastikan Sistem disediakan sebagai Instrumen Optik

Pengimej biologi molekul tidak boleh dibersihkan sekali-sekala sahaja.

Sumber cahaya akan haus dari masa ke masa, penapis mungkin tercalar, dulang sampel boleh bernoda dan habuk boleh menjejaskan kualiti imej. Makmal harus menjejak pencahayaan, memeriksa dulang dan penapis, membuat sandaran protokol pemerolehan, mengemas kini perisian dengan teliti dan mengekalkan dokumentasi penyelenggaraan.

Apabila kualiti imej tidak baik, lalui keseluruhan proses dan lihat jika ada masalah dengan kamera atau rantaian lain. Ini boleh disebabkan oleh kotoran, sampel atau substrat, tetapan pendedahan, sumber cahaya atau penapis.

Kesimpulan

Platform yang paling berguna tidak semestinya yang mempunyai paling banyak ciri. Ia adalah yang menawarkan pencahayaan, kepekaan, julat dinamik, perisian, kawasan pengimejan dan aliran kerja yang sesuai yang boleh dihasilkan oleh pengguna lain.

Pengimejan yang baik bermula dari peringkat penyediaan sampel. Instrumen merekodkan eksperimen, tetapi jika penyediaan ujian dilakukan dengan teliti dan pemerolehan dilakukan berulang kali, maka imej (rekod) itu bermakna.

Soalan Lazim

S1. Apa yang Boleh Ditangkap oleh Sistem Pengimejan Biologi Molekul?

Ia mampu menangkap gel DNA dan RNA, gel protein, western blot kemiluminesen, western blot fluoresen, dan membran kolorimetrik bergantung pada tetapan.

S2. Apakah perbezaan antara Sistem Dokumentasi Gel dan Western Blot Imager?

Tidak selalu. Sistem gel asas mungkin hanya menyokong pengimejan dengan UV, cahaya biru dan putih, dan pengimejan blot Barat mungkin memerlukan pengesanan chemiluminescence sensitif atau fluoresens berbilang saluran.

S3. Mengapa julat dinamik penting? Mengapa julat dinamik itu penting?

Julat dinamik isyarat yang besar membolehkan tangkapan isyarat lemah dan kuat tanpa tepu isyarat terkuat. Ini terutamanya benar dalam analisis kuantitatif.

S4. Bolehkah Pendedahan Automatik dipercayai?

Ia boleh membantu untuk menentukan julat pendedahan permulaan. Pengendali juga perlu memerhati faktor lain seperti ketepuan, latar belakang, isyarat lemah dan mod pengimejan.

S5. Apakah Mod Pengimejan terbaik?

Mod yang digunakan bergantung kepada sampel, pewarnaan, label dan objektif analisis. Sumber cahaya, penapis dan tetapan kamera bergantung pada ujian.