UV Transilluminator: Memilih dan Menggunakan Sistem Yang Sesuai untuk Visualisasi Gel

Hasilnya bermasalah ialah transilluminator UV. Ia membaca jalur DNA, RNA atau protein dengan cara mudah, melalui cahaya ultraviolet melalui gel yang berwarna. Operator kemudian boleh memeriksa gel, mengambil gambar, atau memotong jalur yang dikehendaki untuk digunakan kemudian.

Kebanyakan isu berkaitan selain suis kuasa. Ini disebabkan oleh panjang gelombang yang salah, pencahayaan dan kotoran yang tidak serasi, pendedahan terlalu lama dan kekurangan perlindungan UV.

Aliran kerja transilluminator UV yang baik harus menyediakan jalur yang jelas, dengan pendedahan minimum kepada sampel dan orang yang menggunakan instrumen.

Bagaimana Transilluminator UV berfungsi

Gel kemudian dielektroforesi, meninggalkan serpihan molekul yang biasanya tidak kelihatan dengan mata kasar. Pewarna pendarfluor yang melekat atau berinteraksi dengan bahan yang hendak diwarnakan. Gel berwarna kemudian dipindahkan ke permukaan yang diterangi dan pewarna tersebut dirangsang oleh cahaya ultra-ungu serta menghasilkan fluoresens yang boleh dilihat oleh mata.

Latar belakang gelap dan jalur terang membolehkan anda menganggarkan saiz serpihan, membandingkan intensiti sampel, memeriksa produk penguatan atau mencari bahan untuk pengekstrakan gel.

Terdapat beberapa transilluminator UV yang tersedia pada panjang gelombang standard 254, 302 dan 365 nm. Ada yang menawarkan satu panjang gelombang, yang lain menawarkan dua atau tiga; mana yang terbaik bergantung pada jenis alat muzik dan panjang gelombang yang dikehendaki. Aplikasi pemerhatian gel dan elektroforesis menggunakan julat UV yang luas berhampiran 302 nm.

Pilih Panjang Gelombang untuk Aplikasi sebenar

Intensiti fluoresens, kerosakan pada sampel dan keserasian warna dipengaruhi oleh pemilihan panjang gelombang.

Sumber 302 nm sering digunakan apabila melihat gel DNA dan RNA yang diwarnakan fluoresen kerana ia biasanya menghasilkan isyarat intensiti tinggi dan banyak pewarnaan asid nukleik yang diketahui boleh digunakan dengan sumber ini. Penyelesaian mudah untuk pemeriksaan gel rutin dan dokumentasi.

Jika pengurangan kerosakan DNA yang disebabkan oleh UV lebih penting daripada isyarat terkuat yang mungkin, ia mungkin dipertimbangkan untuk menggunakan UV gelombang panjang, yang hampir 365 nm. Thermo Fisher menasihatkan untuk meminimumkan pendedahan kepada DNA dan mencadangkan penggunaan panjang gelombang yang lebih panjang (sekitar 360 nm) jika DNA dapat diperoleh daripada gel.

Penggunaan UV gelombang pendek (hampir 254 nm) untuk pemerhatian rutin gel DNA tidak harus dianggap automatik, walaupun beberapa transilluminator makmal tersedia. Ia sesuai digunakan bergantung pada bahan pendarfluor dan aplikasi di makmal.

Panjang gelombang terbesar bukanlah pilihan yang paling berkesan. Ia adalah yang sesuai dengan pewarna dan mengekalkan sampel dengan cukup untuk langkah seterusnya.

Gunakan warna pewarna gel yang berbeza untuk sumber cahaya dengan warna yang berbeza

Transilluminator dan pewarna gel harus dianggap sebagai satu sistem optik.

Terdapat pelbagai jenis pewarna dengan ciri-ciri eksitasi dan pelepasan yang berbeza. Satu pewarna mungkin mempunyai pantulan UV yang tinggi, dan pantulan cahaya biru yang rendah, dan sebaliknya. Penapis kamera juga harus membenarkan fluoresens yang dipancarkan menembusi dan menghalang laluan radiasi rangsangan yang tidak diingini.

Sebelum ujian baru:

• Panjang gelombang yang merangsang pewarna adalah lequel. Panjang gelombang yang merangsang pewarna ini ialah 'luequels'.
• Keputusan sama ada untuk menggunakan penapis fotografi atau tidak akan ditentukan oleh jurugambar individu.
• Ciri-ciri bahan pewarna (DNA, RNA atau protein)
• Sama ada gel itu hendak dipotong atau tidak, bagaimana ia akan didokumentasikan?
• Jika sumber cahaya adalah teknologi baru, adakah terdapat kaedah untuk menangkapnya menggunakan sistem pengimejan semasa?

Sebagai contoh, gel berwarna SYBR Safe boleh diimej menggunakan peralatan pendarfluor yang sesuai dengan penapis cahaya UV atau biru - penapis yang digunakan untuk pengimejan etidium-bromida mungkin tidak sesuai.

Jika imej terlalu samar, itu tidak semestinya bermakna terdapat terlalu sedikit DNA dalam gel. Puncanya boleh jadi panjang gelombang rangsangan yang tidak sesuai, penapis kamera yang salah, lampu UV yang digunakan dan usang atau terlalu banyak cahaya bilik.

Jika kerosakan pada DNA dapat dipulihkan, hadkan pendedahan kepada sinaran UV

Asid nukleik mudah rosak akibat cahaya UV. Ini penting jika penyelidik ingin mengekstrak jalur DNA daripada gel dan menggunakan baki DNA dalam aplikasi hiliran seperti kloning, ligasi, penjujukan, atau aplikasi lain.

Pendedahan yang lama boleh menyebabkan DNA tercalar serta kerosakan lain, yang boleh menjejaskan kualiti DNA yang diperoleh. Pendedahan kepada UV untuk tempoh yang lama boleh menyebabkan kerosakan pada DNA yang boleh menjejaskan aplikasi hiliran seperti subkloning, kata Thermo Fisher.

Sekiranya visualisasi UV diperlukan:

1. Sediakan alat pemotong dan tiub pengumpulan sebelum menyalakan lampu.
   1. Tetapkan tetapan terendah yang akan menghasilkan jalur jernih.
   1. Pendedahan harus diminimumkan.
   1. Jika boleh, fikirkan panjang gelombang yang lebih panjang untuk cahaya UV.
   1. Jangan tonton gel yang sama berulang kali.
   1. Catat jalur yang dipilih dan matikan sumbernya.

Transilluminator cahaya biru yang serasi untuk kloning mungkin lebih sesuai untuk kerja kloning yang sangat sensitif. Warna boleh dirangsang oleh cahaya biru, dan kerosakan yang kurang telah didapati berlaku pada DNA oleh cahaya biru.

Periksa Keseragaman Pencahayaan

Transilluminator harus memberikan pencahayaan seragam di kawasan yang akan dilihat.

Jika satu sisi permukaan lebih kuat daripada yang lain, jalur yang sama akan mempunyai intensiti yang berbeza bergantung pada lokasi mereka pada gel. Ini amat relevan apabila lorong dibandingkan di makmal yang sama dan/atau apabila imej digunakan untuk analisis separa kuantitatif.

Keseragaman dipengaruhi oleh keadaan lampu, susunan lampu, penapis, kebersihan permukaan dan reka bentuk optik instrumen. Pencahayaan seragam penting dalam konteks UVP untuk mencapai kebolehulangan hasil dalam pelbagai jalur dan lorong.

Sentiasa periksa latar belakang untuk melihat sama ada ia sekata sepanjang gel, sebelum bergantung pada intensiti gelang. Memindahkan gel yang sama ke bahagian permukaan yang berbeza mungkin membantu membangunkan masalah pencahayaan.

Gunakan kawasan tontonan yang betul

Kawasan permukaan yang diterangi sepatutnya cukup untuk menutup gel tetapi tidak mengambil ruang bangku tambahan.

Sedikit sel sangat sesuai untuk mini gel standard. Platform yang lebih besar akan lebih baik untuk gel format besar, atau beberapa gel secara bersebelahan. Terdapat sistem komersial yang tersedia dengan pelbagai kawasan pencahayaan, biasanya sekitar 20 x 20 cm ke atas.

Semua gel sepatutnya rata di permukaan. Pantulan dan kabur pada jalur boleh berlaku disebabkan oleh kedutan pada filem pelindung, penampan yang terlalu banyak atau dulang yang tidak rata.

Pastikan permukaan tontonan bersih; hanya gunakan bahan dan agen pembersih yang serasi dengan penapis UV. Imej mungkin terjejas oleh calar, kotoran atau deposit penimbal yang kering.

Pastikan pengguna dilindungi daripada pendedahan UV

UV Transilluminator BUKAN lampu tontonan standard, tetapi sumber cahaya dengan intensiti tinggi yang direka untuk digunakan di makmal.

Pendedahan langsung atau tidak langsung kepada sinaran UV boleh menyebabkan kerosakan mata dan kulit. Garis panduan keselamatan makmal Stanford menyenaraikan langkah-langkah berjaga-jaga berikut untuk menggunakan transilluminator: kawal akses kepada transilluminator semasa digunakan, jauhkan permukaan reflektif daripada transilluminator, dan pasang papan tanda yang menunjukkan kulit dan mata harus dilindungi.

Sentiasa gunakan bahagian atas pelindung, pelindung atau kabinet imej tertutup yang disediakan bersama alat tersebut. Amalan makmal yang memerlukan penggunaan gel mungkin memerlukan menutup muka, memakai sarung tangan, kot makmal yang dipasang dan menutup kulit dengan penghalang UV.

Jangan anggap cermin mata keselamatan biasa menghalang panjang gelombang UV. Pakai peralatan pelindung yang sesuai yang telah ditetapkan untuk instrumen dan patuhi peraturan keselamatan radiasi makmal.

Kawalan pendedahan yang lebih baik dicapai dengan sistem dokumentasi gel tertutup dengan kunci keselamatan berbanding bekerja di atas kotak lampu terbuka. Sesetengah sistem tidak membenarkan pintu pengimejan dibuka semasa beroperasi dalam mod UV.

Pendidik harus mewujudkan aliran kerja tontonan yang konsisten

Terdapat satu trek mudah yang boleh digunakan untuk meminimumkan variasi yang tidak perlu:

• Elektroforesis dan Pewarnaan 1. Elektroforesis dan 1 pewarnaan.
• Pastikan pewarna berada pada panjang gelombang yang betul.
• Pastikan bahagian luar dulang gel bersih dan kering.
• Pilih panjang gelombang dan intensiti UV yang diperlukan.
• Letak gel di kawasan tontonan di tengah.
• Tutup pelindung pelindung/kotak pengimejan.
• Gunakan masa pendedahan sesingkat mungkin untuk menghasilkan jalur yang boleh dilihat.
• Ambil gambar dengan penapis pancaran yang sesuai.
• Padamkan cahaya UV semasa menggerakkan gel.
• Lap permukaan selepas digunakan.

Jika menjalankan beberapa eksperimen, kepekatan pewarna harus sama, begitu juga penapis imej, masa pendedahan, tetapan intensiti dan keadaan kamera.

Sambungkan Transilluminator ke dalam Aliran Kerja Pengimejan

Jika pengguna tidak perlu memeriksa gel, maka transilluminator meja boleh digunakan. Untuk aplikasi yang lebih mencabar, sistem dokumentasi gel penuh termasuk kamera, kotak gelap, penapis dan perisian analisis imej diperlukan.

Sistem bersepadu boleh digunakan untuk penangkapan imej, pengukuran jalur, dokumentasi dan analisis gel secara berkala. Bio-Rad mencirikan platform dokumentasi gel, yang menampilkan pencahayaan terkawal serta perisian pemerolehan dan analisis imej automatik.

Keputusan akan bergantung kepada apa yang makmal akan lakukan dengan imej tersebut. Dalam makmal penyelidikan, makmal pengajaran mungkin memerlukan pengesahan visual yang jelas, makmal penyelidikan mungkin memerlukan fail imej yang boleh dijejaki, pendedahan yang konsisten, dan analisis jalur kuantitatif.

Jangan sekali-kali keluarkan Sumber Cahaya

Walaupun lampu UV kelihatan seperti menyala, ia mula kehilangan outputnya dari masa ke masa. Dengan intensiti yang dikurangkan, operator akan meningkatkan masa pendedahan, yang boleh menyebabkan konsistensi yang kurang dan pendedahan sampel yang lebih banyak.

Ikuti garis panduan penyelenggaraan lampu pengeluar. Radiometer UV adalah ukuran yang lebih objektif berbanding anggaran visual dan UVP telah menentukan bahawa pengukuran iramaan adalah kaedah yang sesuai untuk pemantauan jangka hayat berguna sumber UV.

Tukar lampu sebagai satu set jika disyorkan, bersihkan penapis tontonan dengan teliti dan catat tarikh penyelenggaraan. Lampu UV pendarfluor juga boleh mengandungi merkuri dan harus diurus serta dilupuskan sebagai sisa berbahaya mengikut keperluan tempatan.

Kesimpulan

Apabila menggunakan transilluminator UV untuk visualisasi gel, ia boleh dilakukan dengan cepat dan jelas, tetapi tidak boleh hanya terang dalam cahaya ultraviolet untuk mendapatkan hasil yang baik.

Panjang gelombang sepatutnya sesuai untuk pewarnaan dan kegunaan seterusnya. Pencahayaan harus seseragam mungkin, pendedahan sependek mungkin, penapis kamera harus sama dengan pendarfluor yang dipancarkan, dan pengguna harus dilindungi daripada pendedahan UV sumber cahaya.

Instrumen yang tepat ialah yang akan menampung saiz gel, kaedah pewarnaan, keperluan pengimejan, aliran kerja untuk memulihkan sampel dan kawalan keselamatan untuk persekitaran makmal.

Soalan Lazim

S1. Transilluminator UV digunakan untuk apa?

Ia terutamanya digunakan untuk memvisualisasikan jalur DNA, RNA atau protein yang dilabel dengan warna fluoresen dalam gel elektroforesis. Ia juga boleh dimasukkan ke dalam sistem dokumentasi gel.

S2. Antara panjang gelombang berikut yang manakah biasa digunakan untuk DNA Gel?

Penggunaan biasa UV midrange (hampir 302 nm) adalah untuk melihat gel secara rutin. Pilihan akhir harus serupa dengan pewarnaan, serta aplikasi seterusnya.

S3. Adakah Cahaya UV Memutasi DNA?

Ya. Pendedahan jangka panjang boleh menyebabkan kerosakan DNA dan mengurangkan kebolehklonan DNA serta aplikasi seterusnya.

S4. Mana yang lebih berkesan: Cahaya Biru atau Cahaya UV?

Jika kerosakan UV pada pengguna dan/atau kerosakan DNA menjadi kebimbangan, penggunaan cahaya biru disyorkan untuk pewarnaan yang serasi. Walaupun untuk beberapa kesan yang diketahui, UV mungkin memberikan rangsangan yang lebih baik.

S5. Mengapa terdapat kelemahan pada Gel Bands?

Ini mungkin disebabkan oleh kepekatan sampel yang rendah, pewarnaan yang tidak sesuai, panjang gelombang atau penapis yang tidak sesuai, lampu yang menua, terlalu banyak cahaya latar, atau pewarnaan yang lemah.