Penampan Elektroforesis Ultra-Pantas: Gel DNA Lebih Pantas Tanpa Kehilangan Kejelasan

Walaupun elektroforesis gel agarosa mudah dan boleh dipercayai, masa untuk elektroforesis konvensional kadangkala menjadi faktor yang mengehadkan dalam makmal biologi molekul yang sibuk. Jika makmal menjalankan beberapa tindak balas PCR, pencernaan sekatan atau sampel pengklonan setiap hari, larian selama 30 minit boleh menjadi halangan besar apabila beberapa gel diproses setiap hari.

Penimbal elektroforesis ultra-pantas dirumuskan dengan kekuatan ionik yang lebih rendah, yang mengurangkan kekonduksian dan arus pada kekuatan medan elektrik tertentu dan seterusnya mengehadkan pemanasan Joule. Ini membolehkan kekuatan medan yang lebih tinggi digunakan dalam keadaan yang disahkan, memendekkan masa pemisahan sambil mengekalkan resolusi jalur yang berguna.

Ultra Pantas elektroforesis Buffer—Apa itu?

Penampan elektroforesis ultra pantas ialah penimbal elektroforesis kekuatan ion rendah yang telah dioptimumkan untuk pemisahan cepat serpihan DNA dalam gel agarosa. Membekalkan ion yang diperlukan untuk kekonduksian elektrik dan untuk keadaan kimia semasa migrasi.

Kekuatan ion penimbal ini lebih rendah daripada kebanyakan penimbal tradisional, jadi kurang haba dihasilkan pada keadaan operasi tertentu disebabkan arus. Ini membolehkan penggunaan kecerunan voltan yang lebih tinggi di makmal dan memendekkan masa operasi.

Longlight's 50X Penampan Larian Sangat Pantas disediakan sebagai larutan pekat, dan akan memendekkan masa pemisahan daripada 30 minit biasa kepada kira-kira 5-10 minit mengikut keadaan yang disyorkan.

Sebabnya lebih rendah Kekuatan ionik boleh meningkatkan kelajuan larian?

DNA mempunyai cas negatif dan bergerak ke arah elektrod positif dalam medan elektrik. Semakin tinggi medan elektrik, semakin laju DNA bergerak, namun, penimbal konvensional boleh menghasilkan haba yang ketara pada medan elektrik yang tinggi.

Kepanasan berlebihan boleh menyebabkan agarosa cair, menyebabkan lorong bengkok, jalur melengkung atau kerosakan pada peralatan elektroforesis. Penimbal kekuatan ionik rendah menghasilkan arus yang lebih rendah; kurang haba dijana, menjadikan operasi pada voltan lebih tinggi lebih mudah.

Ini bukan bermakna voltan boleh dinaikkan tanpa had. Dimensi gel, kedalaman penampan, reka bentuk ruang, serta suhu persekitaran dan kapasiti bekalan kuasa terus mempengaruhi jalanan.

Will Faster elektroforesis mengakibatkan Kurang Resolusi?

Apabila penimbal, kepekatan agarosa, voltan dan jarak larian sesuai dengan sampel, pemisahan yang baik boleh dicapai dengan larian pantas. Keadaan biasanya tidak diperiksa apabila kaedah dipindahkan, yang mengakibatkan resolusi yang lemah.

Untuk serpihan berpisah, ia mesti mempunyai jarak migrasi yang mencukupi jika saiznya hampir sama. Jika siri dihentikan terlalu awal, ia mungkin dimampatkan, walaupun pewarna penjejak dilihat telah bergerak, berhampiran perigi.

Adalah penting bagi makmal untuk mengenal pasti perbezaan antara analisis untuk menentukan kehadiran atau ketiadaan dan gel analitik beresolusi tinggi. Yang pertama mungkin perlu mempunyai masa gel yang lebih pendek, dan yang kedua mungkin memerlukan masa gel yang lebih lama atau voltan sedikit lebih rendah.

Cara Menyediakan Penampan Kerja 1X daripada Konsentrat 50X?

50 X pekatan harus dicairkan menjadi larutan kerja 1 X. Sebagai contoh, untuk menghasilkan 1 L penimbal kerja 1X, campurkan 20mL pekatan 50X dengan 980ml air suling atau tanpa mineral.

Goncang dengan baik sebelum mencetak atau mengisi ruang. Untuk penyediaan gel agarosa dan tangki larian, gunakan persediaan 1X yang sama untuk mengekalkan konsistensi dalam kekonduksian sistem.

Jangan cairkan penimbal di bawah kepekatan kerja yang disyorkan untuk tujuan mengurangkan arus lebih lanjut. Penampan yang lemah dan/atau corak jalur yang tidak konsisten boleh berlaku akibat kepekatan yang salah yang boleh menyebabkan migrasi yang tidak normal.

Apakah itu Betul Voltan yang perlu ditetapkan?

Voltan harus ditentukan oleh panjang gel efektif, dan bukan sekadar dipilih daripada tetapan biasa pada bekalan kuasa. Longlight mengesyorkan penggunaan kira-kira 25–30 V/cm panjang gel dengan penimbal yang berjalan pantas.

Tetapi tetapan akhir juga harus mengambil kira ruang elektroforesis dan jenis gel serta suhu penimbal. Voltan akhir juga harus mengambil kira panjang gel, beban sampel, reka bentuk ruang dan suhu penimbal.

Bekalan kuasa perlu stabil dalam output pada tetapan yang dikehendaki. Bekalan kuasa elektroforesis EP-600 buatan Longlight direka untuk menyediakan bekalan kuasa elektroforesis yang stabil untuk makmal.

Gel Apa Syarat-syarat Tidak berubah?

Penampan tidak dapat mengatasi penggunaan kepekatan agarosa yang tidak sesuai. Kepekatan agarosa yang lebih rendah cenderung menyokong serpihan berat molekul yang lebih tinggi, dan semakin tinggi kepekatan agarosa, semakin baik pemisahan fragmen DNA yang lebih kecil.

Ketebalan gel juga penting. Gel pekat mungkin mengambil masa lebih lama untuk diwarnakan dan mungkin mempunyai lebih banyak haba. Pembentukan telaga yang bersih dan sampel pemuatan tanpa merosakkan tepi.

Ruang mendatar yang serasi membolehkan penyamaan keadaan elektrik. Sistem Gel Mendatar HE-50 serasi dengan pelbagai sistem gel dan menampilkan reka bentuk ruang penimbal yang rendah.

Apakah Kaedah Pewarnaan dan Visualisasi yang Perlu Digunakan untuk DNA?

Bergantung pada produk dan protokol, pewarna asid nukleik boleh dimasukkan semasa penyediaan gel atau boleh digunakan selepas elektroforesis. Apabila membandingkan penimbal pantas dengan kaedah pewarnaan sedia ada, kaedah pewarnaan mesti sama.

Larian yang sangat pendek boleh menjejaskan persepsi intensiti pewarnaan, terutamanya jika jalur berjarak pendek. Adalah penting untuk melaraskan pendedahan, oleh itu, akibat daripada perkara di atas, tidak meniru pendedahan automatik daripada larian konvensional.

LongLight's Pewarnaan Asid Nukleik RedView boleh digunakan untuk memvisualisasikan DNA dan RNA dalam gel agarosa dan poliakrilamida serta berfungsi dengan peralatan pengimejan biasa.

Adakah itu mungkin untuk mendapatkan DNA selepas larian pantas?

Ya, selagi penimbal dan pewarna tidak memberi kesan kepada pengekstrakan gel dan tindak balas seterusnya. Menurut Longlight, 50X Super Fast Running Buffer tidak menjejaskan pengekstrakan atau ligasi gel DNA.

Kurangkan pendedahan yang tidak perlu kepada cahaya UV dan buang hirisan gel sekecil mungkin untuk pemulihan terbaik. Jalur harus dikekalkan berasingan supaya cukup berbeza supaya tiada produk jiran dimasukkan.

Apabila pengesahan kaedah adalah untuk kloning atau penjujukan atau proses hiliran sensitif lain, nilai hasil, ketulenan, dan prestasi DNA yang dipulihkan.

Bila Perlu Tukar Penimbal Berjalan?

Sesetengah penimbal boleh digunakan semula tetapi penggunaan semula harus dikawal dan bukan hanya berdasarkan penampilan. Dengan larian berulang, suhu, taburan ion dan prestasi penimbal mungkin berubah.

Jika migrasi menjadi perlahan, jalur tidak seperti yang dijangka atau larutan menjadi tercemar, gantikan penimbal tersebut. Satu lagi sebab mengapa ini masa yang baik untuk memeriksa penimbal adalah kerana suhu bilik tinggi, dan selepas dua kali berturut-turut, larian yang lebih pantas.

Jika sampel penting atau mempunyai input rendah, adalah disyorkan agar penimbal kerja segar digunakan untuk mengelakkan variasi yang tidak perlu.

Apakah langkah yang betul untuk Makmal mengesahkan Switch?

Gunakan tangga DNA dan sampel yang diketahui. Gunakan kepekatan gel, isipadu sampel dan kaedah pewarnaan yang sama pada penimbal sedia ada dan penimbal ultra-pantas dan jalankan secara selari.

Padankan masa jalan, bentuk jalur, pemisahan serpihan rapat serta konsistensi migrasi dan kualiti imej. Apabila pengekstrakan gel terlibat dalam aliran kerja, nilai hasil pengekstrakan gel dan satu tindak balas seterusnya juga.

Setelah diterima, dokumentasikan pencairan, kecerunan voltan, saiz gel, panjang laluan dan bagaimana gel diwarnakan serta berapa kali penimbal digunakan. Longlight's reagen am dan bahan habis pakai direka untuk memudahkan aplikasi genomik dan biologi molekul secara berkala.

Kesimpulan

Penimbal elektroforesis ultra pantas boleh mengubah analisis gel agarosa menjadi pemeriksaan kualiti yang pantas. Kelebihannya ialah ia membolehkan kekuatan ionik yang lebih rendah namun kekuatan medan elektrik yang boleh digunakan lebih tinggi.

Walau bagaimanapun, semua aspek penyediaan 1X, padanan gel dan penimbal larian, kepekatan agarosa dan kawalan suhu masih penting untuk memastikan hasil yang boleh dipercayai. Pengesahan sebelah-menyebelah yang singkat membolehkan makmal memendekkan masa operasi tanpa mengorbankan pemisahan jalur yang boleh ditafsir.

Soalan lazim

Q1. Bolehkah penimbal elektroforesis ultra pantas digunakan bersama gel DNA?

Ya. Direka untuk pemisahan DNA yang pantas dalam gel agarose. Pengguna dinasihatkan untuk mengesahkan keserasian ruang gel, pewarnaan dan aliran kerja hiliran.

Q2. Adakah penimbal 50X sedia untuk digunakan?

Tidak. Pekatan 50X mesti dicairkan kepada 1X sebelum penyediaan gel atau elektroforesis. Menggunakan pekatan secara langsung akan menghasilkan kekuatan dan konduktiviti ionik yang terlalu tinggi, menyebabkan arus dan haba yang dihasilkan secara berlebihan semasa elektroforesis.

Q3. Adakah penimbal yang sama digunakan untuk pengecoran dan menjalankan gel?

Ya, kumpulan penimbal kerja 1X yang sama disyorkan untuk kedua-duanya. Ini membantu mengekalkan kekuatan penimbal di seluruh sistem gel.

Q4. Adakah gel menjadi panas jika voltan dinaikkan?

Jika tidak menampan dengan mencukupi, keadaan voltan atau ruang tidak sesuai. Untuk beberapa kali operasi dan/atau makmal panas, pantau suhu penimbal.

Q5. Adakah mungkin untuk mendapatkan DNA daripada pemisahan elektroforetik pantas untuk ligasi?

Ya, jika pewarna dan penimbal yang sesuai digunakan. Pengesahan awal makmal harus merangkumi prestasi pemulihan dan ligasi.