Reseptor Gandeng Protein: Dari Isyarat Sel hingga Penemuan Ubat

Reseptor berpasangan protein G, atau GPCR secara ringkas, ialah protein membran yang membantu sel bertindak balas terhadap isyarat dari luar sel. Isyarat ini mungkin merangkumi hormon, neurotransmitter, lipid, peptida, serta cahaya.

Walaupun terdapat persamaan struktur yang jelas dalam struktur tujuh transmembran GPCR, mereka tidak berfungsi dengan cara yang sama. Keputusan eksperimen mungkin bergantung pada ligan untuk reseptor, persekitaran sel, tahap ekspresi reseptor, dan pasangan isyarat.

Penyelidik, oleh itu, perlu melangkaui pengukuran "pengaktifan" reseptor sebatian untuk mentafsir biologi GPCR. Semua laluan, masa, format ujian, kawalan dan model sel adalah penting.

Reseptor Gandeng Protein G: Apakah ia?

Bilangan kali GPCR tipikal akan melintasi membran sel adalah 7. Bahagian ekstraselular mengikat molekul isyarat dan bahagian intraselular mengikat protein G, arrestin, kinase dan molekul isyarat lain.

GPCR diklasifikasikan kepada beberapa kelas utama oleh Panduan Farmakologi IUPHAR/BPS, seperti reseptor Kelas A, B, Kelas C, Frizzled dan Adhesion. Kelas A adalah yang terbesar, dan melibatkan sasaran yang sudah diketahui seperti reseptor adrenergik, dopamin, opioid dan muskarinik.

Walaupun serupa dari segi struktur, GPCR mampu mengenal pasti set isyarat yang sangat pelbagai. Ini membolehkan mereka terlibat dalam persepsi deria, pengawalan kardiovaskular, metabolisme, fungsi imun, mood, pergerakan dan banyak lagi.

Bagaimana GPCR Diaktifkan?

Ligan melekat pada reseptor, dan menyebabkan reseptor berubah bentuk. Hasil daripada perubahan konformasi ini, reseptor dapat berinteraksi dengan protein isyarat intrasel.

Banyak GPCR mempunyai protein G heterotrimeric sebagai pasangan pertama yang terdiri daripada subunit alfa, beta dan gamma. Pengaktifan reseptor menghasilkan pertukaran KDNK kepada GTP dalam subunit alfa. Komponen yang diaktifkan kemudian mempengaruhi enzim hiliran, saluran ion dan pembawa mesej kedua.

Keluarga protein G yang paling popular adalah:

• Gs, yang biasanya menyebabkan peningkatan AMP kitaran
• Nama yang biasa digunakan untuk enzim pengurang AMP kitaran ialah gi/o.
• Laluan Gq/11 yang menandakan laluan fosfolipase C dan kalsium
• Tindak balas protein keluarga Rho dan sitoskeleton boleh dikawal oleh G12/13.

Penerangan dalam buku teks ini membantu, tetapi garis adalah bentuk isyarat yang jarang berlaku! Satu reseptor tunggal boleh menghantar isyarat melalui pelbagai protein G dan transduksi isyarat optimum boleh berbeza bergantung pada ligan dan jenis sel. GPCRdb menyebut bahawa reseptor boleh berinteraksi dengan protein G, kinase GPCR dan arrestin, yang membawa kepada pembentukan pelbagai laluan isyarat intrasel.

Peranan arrestin

Setelah protein G diaktifkan, isyarat oleh GPCR tidak berhenti.

Kinase GPCR mampu memfosforilasi reseptor yang diaktifkan. Arrestin kemudian boleh berinteraksi dengan reseptor, menghalang sambungan selanjutnya reseptor kepada protein G, memudahkan penginternalan reseptor dan terlibat dalam laluan transduksi isyarat lain.

Oleh itu, pengambilan arrestin tidak boleh dianggap sebagai "suis mati." Bergantung pada reseptor dan eksperimen, ia boleh mempengaruhi penghantaran, desensitisasi, kitar semula, degradasi reseptor atau memodulasi kesan seterusnya yang lain.

Oleh kerana kedua-dua isyarat protein G dan pengambilan arrestin adalah ukuran penting dalam farmakologi lengkap sebatian, ia sering diukur bersama.

Artikel dalam bahagian ini mengkaji cara-cara di mana reseptor yang sama boleh membawa kepada tindak balas yang berbeza

GPCR bukan sekadar suis hidup/mati.

Pelbagai ligan boleh didapati mengikat fasa konformasi reseptor yang berbeza. Satu jenis ligan boleh menyebabkan tahap pengaktifan yang tinggi pada satu laluan protein G berbanding laluan yang satu lagi boleh menyebabkan perekrutan arrestin yang lebih tinggi atau profil isyarat yang berbeza. Ia biasanya dirujuk sebagai selektiviti fungsional/isyarat bias.

Latar belakang sel juga penting. Reseptor yang sama boleh ditemui dalam dua makmal berbeza, tetapi mempunyai jumlah protein G, arrestin, kinase, enzim, atau reseptor endogen yang berbeza dalam sel.

Masalah lain mungkin tahap ekspresi reseptor. Ekspresi berlebihan boleh meningkatkan tindak balas terhadap tahap aktiviti yang rendah dan/atau mengubah keutamaan penyambungan, serta boleh menyebabkan agonis separa mempunyai aktiviti yang lebih kuat dalam sel berbanding tisu asli.

Oleh itu, keputusan harus diambil sebagai petunjuk tingkah laku sistem eksperimen lengkap dan bukan hanya reseptor sahaja.

Pilih Ujian berdasarkan soalan biologi

Tiada satu pun ujian GPCR boleh menjawab semua soalan.

Ujian cAMP

Reseptor dengan protein Gs atau Gi biasanya diukur menggunakan cAMP. Tindak balas Gs boleh menyebabkan peningkatan cAMP dan tindak balas Gi boleh ditunjukkan melalui penghambatan penghasilan cAMP yang dirangsang.

Ujian ini biasa digunakan dalam kajian kepekatan tindak balas, kajian pencirian agonis dan kajian antagonis. Dalam eksperimen antagonis, kepekatan agonis biasanya digunakan selepas pendedahan sebatian ujian kepada sel.

ujian kalsium

Reseptor berpasangan Gq boleh dikaji melalui ujian intraselular kalsium. Ia boleh memberikan bacaan yang pantas dan berkelajuan tinggi, tetapi tindak balas mungkin singkat dan sangat bergantung pada pengendalian sel, pemuatan pewarna, ekspresi reseptor, dan masa pengukuran.

Pengikatan GTPγS

Ujian GTPγS adalah salah satu peristiwa terawal yang diukur dalam proses pengaktifan protein G dan sering digunakan untuk mengesahkan aktiviti agonis dalam penyediaan membran. Oleh kerana ujian ini agak dekat dengan interaksi reseptor–protein G, ia boleh mengurangkan beberapa penguatan yang dialami dalam bacaan hiliran.

Pengambilan Tangkap

Ujian arrestin boleh digunakan untuk menyiasat bias laluan, isyarat khusus ligan, pengedaran reseptor dan desensitisasi reseptor. Ia paling baik digunakan bersama dengan ujian protein G dan bukan sebagai penunjuk umum pengaktifan reseptor.

Biosensor Sel Hidup

Teknik BRET dan FRET (dan kaedah biosensor lain) boleh menjejak peristiwa isyarat dalam sel hidup sebagai fungsi masa. Kelebihan terbesar di sini ialah maklumat kinetik: penyelidik dapat mengukur bila isyarat bermula, bila ia mencapai kemuncak dan kemudian menurun, kerana mereka mengukur lebih daripada satu titik akhir.

Buat Eksperimen GPCR yang tepat

Ujian yang baik adalah berdasarkan biologi dan bukan instrumen.

Untuk memulakan, pastikan reseptor dinyatakan dan terletak di lokasi yang betul dalam membran sel. Tindak balas yang rendah mungkin bukan disebabkan oleh aktiviti ligan yang rendah, tetapi akibat ekspresi/pergerakan reseptor yang lemah.

Kedua, tambah peranti kawalan yang sesuai. Biasanya, agonis yang diketahui, antagonis yang diketahui, kawalan kenderaan, sel yang belum ditransfeksi dan kawalan bebas reseptor untuk ujian hiliran mungkin diperlukan.

Akhir sekali, lakukan lengkung kepekatan dan tindak balas yang lengkap. Penilaian hanya satu kepekatan sebatian tidak akan menjadi ukuran yang boleh dipercayai bagi keberkesan, keberkesanan, agonisme separa, toksisiti, atau gangguan tidak spesifik terhadap ujian.

Penyeragaman masa juga diperlukan. Setelah anda mendapat isyarat kalsium, dalam beberapa saat, dan beberapa jam kemudian anda mengukur ekspresi gen, anda tidak boleh sekadar membandingkan kedua-duanya. Ujian yang mengukur reseptor yang sama boleh digunakan untuk mengukur fasa tindak balas yang berbeza.

Akhir sekali, sahkan keputusan signifikan menggunakan pendekatan ortogonal. Jika sesuatu sebatian didapati aktif dalam ujian cAMP, adalah lebih baik untuk mengesahkannya dengan ujian berguna lain, ujian pengikatan atau dengan kawalan positif khusus reseptor. Manual Panduan Ujian mencadangkan bahawa pengesahan teliti, kawalan kualiti dan pencirian farmakologi terhadap kejayaan GPCR dalam bergerak ke arah pengoptimuman lead akan disyorkan.

GPCR untuk Penemuan Ubat

GPCR terus memainkan peranan penting dalam penemuan ubat kerana ia terlibat dalam pelbagai aspek fisiologi dan diekspresikan secara permukaan pada sel. GPCRdb menganggarkan bahawa 25% hormon manusia terlibat sebagai tindak balas kepada ahli keluarga reseptor ini, dan kira-kira 1/3 daripada semua ubat menyasarkan ahli keluarga reseptor ini.

Untuk program tradisional, sasaran carian utama adalah sama ada agonis atau antagonis yang mengikat ke tapak pengikatan ligan utama. Penyelidikan modulator alosterik, ligan bias-laluan, selektiviti reseptor – transduser, kinetik pengikatan dan reka bentuk sebatian berasaskan struktur juga sedang dikaji sekarang.

Dengan kemunculan biologi struktur, ini menjadi lebih praktikal. GPCRdb kini merangkumi alat untuk membandingkan tapak pengikatan dan keadaan pengaktifan GPCR, termasuk struktur reseptor yang ditentukan secara eksperimen, kompleks reseptor–ligan dan kompleks protein reseptor–G.

Sebatian dengan struktur yang baik harus menjalani ujian fungsi walaupun mempunyai struktur yang baik. Molekul boleh mengikat sasaran yang sesuai dengan afiniti pengikatan yang kuat dan tidak mencetuskan tindak balas selular yang diinginkan atau sebaliknya, molekul boleh mengaktifkan laluan yang dikehendaki tetapi tidak dengan cara yang betul.

Kesimpulan

Reseptor berpasangan protein G paling baik dianggap bukan sekadar suis membran, tetapi sistem isyarat yang fleksibel.

Reseptor berubah bentuk sebagai tindak balas kepada pengikatan ligan, reseptor mencari pasangan dalam sel dan persekitaran sel menentukan perjalanan isyarat. Itulah sebabnya penting untuk mempertimbangkan pemilihan ujian, ekspresi reseptor, masa laluan, kawalan dan pengesahan ortogonal.

Kesimpulan terbaik untuk penyelidikan GPCR dan penemuan ubat sering dicapai hasil gabungan maklumat struktur, dan lebih daripada satu ujian fungsi.

Soalan Lazim

S1. Apakah fungsi utama GPCR?

GPCR ialah reseptor permukaan sel yang bertindak balas kepada isyarat ekstraselular dan menghasilkan tindak balas intrasel. Jawapannya mungkin melalui protein G, arrestin, pembawa mesej kedua, saluran ion atau pengawalan gen.

S2. Adakah semua GPCR diaktifkan oleh protein G yang sama?

Tidak. Pelbagai reseptor boleh memilih untuk mengaktifkan pelbagai protein G (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 atau beberapa rakan isyarat).

S3. Apakah itu Orphan GPCR?

GPCR yatim adalah reseptor yang ligan pengaktifnya secara semula jadi tidak pasti. Reseptor ini masih sangat penting dalam penyelidikan asas dan pembangunan ubat.

S4. Jadi, Assay mana yang patut digunakan untuk saringan GPCR?

Ujian "terbaik" bergantung pada soalan yang dijawab dan laluan isyarat reseptor. Aspek tindak balas yang berbeza boleh diukur melalui cAMP, kalsium, GTPγS, arrestin dan ujian biosensor sel hidup.

S5. Apakah sebab penyelidik menggunakan lebih daripada satu ujian?

Satu ujian hanya boleh mengukur satu laluan atau mempunyai gangguan khusus format. Jika dapat dibuktikan dengan ujian ortogonal bahawa kesan yang diperhatikan memang berkaitan dengan reseptor, maka adalah mungkin untuk menyimpulkan bahawa ini benar-benar kesan reseptor tersebut.