Sistem Pemecahan DNA Ultrasonik: Apa Yang Menjadikan Pencilan DNA Boleh Diulang?

Memecahkan DNA bukanlah masalah besar.

Bahagian penting adalah memecahkannya kepada taburan fragmen yang berguna dan boleh diulang, dari satu sampel ke sampel lain, dari satu hari ke hari lain.

Oleh itu, keupayaan untuk memotong DNA genom tidak seharusnya menjadi satu-satunya kriteria yang digunakan untuk menilai sistem fragmentasi DNA ultrasonik. Sebaliknya, persoalan untuk makmal NGS ialah sama ada sampel boleh ditakrifkan dengan jelas dan diletakkan dalam instrumen hari ini, minggu depan, atau di tangan makmal lain dan masih boleh diteruskan ke penyediaan perpustakaan tanpa perlu memikirkan semula keseluruhan proses.

Daripada menjadi proses sonikasi berdiri sendiri, fragmentasi akustik terkawal adalah sebahagian daripada Longlight Ricih DNA/RNA aliran kerja, yang direka untuk penyediaan sampel NGS. Perbezaan ini boleh membantu apabila mereka bentuk teknik yang mesti disesuaikan dengan kerja makmal harian.

Sentiasa mulakan dengan Profil Fragmen dan BUKAN tetapan kuasa.

Bukan matlamat eksperimen untuk menetapkan alat muzik.

Matlamatnya adalah populasi DNA yang dikeluarkan dari tiub.

Definisi apa yang dijangka selepas aliran kerja perpustakaan adalah tempat pertama untuk bermula dan kemudian bekerja ke belakang kepada protokol akustik. Tetapan yang menjana taburan bermanfaat untuk satu array DNA tidak sepatutnya dianggap sebagai protokol universal untuk array lain.

Ini amat kritikal dalam kes pemindahan kaedah. Mudah untuk meniru program sonikasi dari eksperimen sebelumnya dan menganggap tugas itu sudah selesai. Kepekatan sampel, isipadu sampel, keadaan DNA, jenis tiub dan sejarah pemprosesan adalah sebahagian daripada kaedah dalam amalan.

Oleh itu, sistem mesti disahkan berdasarkan sampel sebenar, bukannya berdasarkan nombor menarik yang dipaparkan pada skrin meter.

DNA datang kepada Sonicator dengan masa lalu.

"DNA genomik" yang terdapat dalam dua tiub tidak semestinya input yang sama.

Seseorang boleh memasukkan DNA dengan berat molekul tinggi daripada ekstraksi bersih. Seorang lagi mungkin telah mengalami proses penyimpanan, pengendalian berganda atau penulenan penyimpanan sebelum permulaan fragmentasi.

Itu penting kerana langkah shearing adalah langkah tengah dalam langkah yang lebih besar.

Makmal harus terlebih dahulu mengenal pasti pembolehubah yang boleh dikawal (isipadu sampel, julat kepekatan DNA, jenis bekas, keadaan suhu dan protokol pengendalian) sebelum mengoptimumkan protokol pemecahan DNA ultrasonik. Jika tidak, kerosakan mungkin muncul beberapa langkah ke hadapan sebagai masalah instrumen yang jelas.

Dalam hampir semua kes ultrasound fokus, tenaga diberikan kepada sasaran.

Kaedah sonikasi tradisional cenderung menyebabkan penyelidik lebih mengambil kira jumlah ultrasound yang dihasilkan. Soalan lain tentang ultrasonifikasi fokus ialah: Ke mana tenaga akustik itu pergi?

Sistem BoFU Longlight tidak memerlukan probe dimasukkan ke dalam sampel biologi, tetapi memerlukan aspek tenaga akustik terfokus dalam media akustik. Menggunakan pemprosesan tanpa sentuhan dan kawalan suhu bersepadu, BoFU-100 Ultrasonicator Fokus dikatakan direka untuk pengikisan DNA, RNA dan kromatin, serta pemecahan genom, untuk NGS.

Susunan tertutup tanpa sentuhan ini memudahkan untuk pemecahan DNA kerana sampel tidak memerlukan sentuhan langsung dengan probe sonifikasi. Ia juga meminimumkan pembolehubah sentuhan sampel dan pembersihan yang sepatutnya dimasukkan dalam protokol.

Ia tidak semestinya "lebih banyak ultrasound".

Ia adalah penghantaran ultrasound yang lebih terkawal.

Suhu adalah sebahagian daripada Kaedah Pemecahan!

Haba mudah diabaikan kerana ia bukan pembolehubah berasingan dalam fail penjujukan terakhir.

Keadaan terma semasa sonasi, bagaimanapun, adalah sebahagian daripada persekitaran pemprosesan sampel. Jika sejarah suhu berbeza untuk satu larian berbanding yang lain, maka protokol akan dihasilkan secara berbeza.

Oleh itu, penting untuk memikirkan pengurusan suhu lebih awal dalam proses reka bentuk sebelum akustik, dan bukan sebagai sekadar peralatan.

Reka bentuk ultrasonicator fokus Longlight termasuk pemprosesan sampel suhu rendah dan suhu malar serta pengesanan bersepadu untuk mengawal haba yang dihasilkan semasa rawatan ultrasonicator.

Untuk pembangunan kaedah, iaitu, merekod keadaan berkaitan suhu, sama seriusnya dengan program sonikasi itu sendiri.

Apakah Maksud "Boleh Diulang" dengan Throughput?

Apa yang berjalan lancar dengan satu tiub akan menjadi rumit jika 20 atau 40 sampel masuk sebelum makan tengah hari.

Jadi pada ketika itu ia lebih kepada isu throughput.

Sampel boleh disimpan untuk tempoh masa yang berbeza sebelum diproses. Tetapan boleh dimasukkan beberapa kali oleh operator. Terdapat variasi antara jenis spesimen. Aliran kerja sebegini, yang melibatkan banyak kerja manual berulang, boleh menyebabkan variasi walaupun teknologi akustik itu sendiri stabil.

Longlight's BoFU-800 Focused Ultrasonicator mempunyai keupayaan untuk memproses antara 1-8 sampel, dengan syarat yang boleh dioptimumkan, dan tetapan kelompok yang boleh digunakan jika beberapa sampel diproses serentak.

Yang BoFU-1600 Ultrasonik Fokus direka untuk mengendalikan sampel dalam saiz kelompok yang lebih besar dengan 16 posisi sampel dan keupayaan untuk diproses secara individu atau secara kumpulan.

Soalan penting tentang pembelian ialah, "Sistem mana yang mempunyai posisi paling banyak?"

Iaitu, "berapa banyak sampel sebenarnya diproses bersama, dan berapa kerap sampel itu memerlukan protokol yang berbeza?"

Lihat lebih daripada saiz fragmen purata

Sampel DNA yang berjaya tidak bermakna aliran kerja pemecahan DNA yang berjaya.

Larian pengesahan tidak sepatutnya menjadi larian paling bersih, tetapi merangkumi replikasi dan kelompok. Saintis harus mempertimbangkan sama ada taburan fragmen masih sesuai, jika terdapat ekor yang luar biasa atau jika taburan fragmen menjadi lebih luas, dan sama ada penyediaan perpustakaan hiliran berfungsi dengan konsisten.

Ini juga merupakan titik di mana makmal harus memutuskan bagaimana kualiti serpihan akan diperiksa secara rutin.

QC hanya dijalankan semasa pembangunan kaedah dan tidak digunakan untuk pemprosesan rutin, perubahan kecil boleh terkumpul sebelum sesiapa dapat mengesannya.

Niatnya bukan untuk menunjukkan keupayaan sonicator memecahkan DNA sekali sahaja.

Idenya adalah untuk mencipta proses yang boleh diulang.

Pilih alat muzik di sekitar bangku, bukan di sekitar brosur.

Setiap makmal mempunyai faktor had tersendiri.

Kumpulan penyelidikan kecil yang mengambil beberapa sampel DNA, RNA atau kromatin sekali-sekala mungkin menghargai aliran kerja bersepadu yang kecil. Makmal penjujukan yang melakukan beberapa sampel serentak mungkin lebih berminat dalam pemprosesan selari. Mungkin memerlukan lebih banyak kapasiti dan tetapan yang boleh diulang/dijejaki antara operator dalam kemudahan teras.

Oleh itu, tidak mungkin untuk memilih sistem yang betul hanya berdasarkan teknologi akustik.

Menurut Longlight sendiri Soalan Lazim Ultrasonikat Fokus, daripada hanya memilih spesifikasi, pertimbangkan faktor seperti kawalan tenaga akustik, konsistensi saiz serpihan, kapasiti pemprosesan, keserasian tiub, penyelenggaraan, bajet perkhidmatan dan bajet makmal.

Semakan Pengesahan Akhir

Sebelum menggabungkan sistem pemecahan DNA ultrasonik ke dalam protokol penyediaan NGS biasa anda, ajukan beberapa soalan praktikal.

Adakah mungkin untuk mendapatkan profil fragmen yang dikehendaki di makmal dalam lebih daripada satu sampel? Adakah terdapat syarat input yang ditetapkan? Adakah suhu dikawal? Adakah format tiub/sampel sesuai untuk protokol? Adakah mungkin untuk mencapai throughput yang lebih tinggi tanpa memperkenalkan sebarang variasi manual yang berlebihan?

Jika jawapan kepada soalan-soalan itu jelas, maka langkah sonikasi untuk mencipta genom yang terpecah bukan lagi tentang langkah sonikasi berdiri sendiri, tetapi lebih kepada apa yang sepatutnya: penyerahan terkawal ke dalam penyediaan perpustakaan.

Soalan lazim

S1. Apakah sistem pemecahan DNA ultrasonik?

Ia memotong DNA secara mekanikal kepada serpihan yang lebih kecil, pada tenaga akustik terkawal, untuk digunakan dalam aliran kerja termasuk penyediaan perpustakaan NGS. Tenaga ini boleh dihantar melalui sistem fokus melalui medium akustik tanpa perlu menyentuh sampel dengan probe.

S2. Bolehkah fragmentasi DNA NGS dilakukan dengan ultrasonik fokus?

Ya. Menurut senarai yang diterbitkan oleh Longlight, fragmentasi genom untuk NGS adalah salah satu aplikasi bagi sistem ultrasonikator berfokus BoFU Longlight. Masih terdapat beberapa syarat protokol yang perlu dioptimumkan untuk sampel dan aliran tertentu.

S3. Adakah lebih banyak kuasa ultrasonik bermakna lebih baik?

Tidak. Matlamatnya bukan semestinya tenaga akustik maksimum tetapi taburan fragmen yang boleh dihasilkan semula yang boleh digunakan untuk pemprosesan hiliran selanjutnya. Tetapan harus bergantung pada keadaan sampel dan protokol.

S4. Mengapa penting untuk mengawal suhu semasa proses ricih DNA?

Sifat proses ultrasonik ialah haba akan dijana, menjadikan suhu sebagai parameter pemprosesan. Keadaan terma terkawal penting untuk mengekalkan larian yang setara apabila diulang menggunakan kaedah fragmentasi yang sama.

S5. Sistem throughput yang mana satu patut saya pilih?

Mulakan dengan mempertimbangkan bilangan sampel yang biasanya diproses pada satu masa dan sama ada sampel perlu diproses di bawah keadaan yang sama atau berbeza. BoFU-800 boleh menampung 1–8 pemprosesan sampel dan BoFU-1600 mempunyai 16 posisi sampel untuk aliran kerja yang lebih besar.